Genomförande av ett permeabelt membran Insert-baserade Infection System för att studera effekterna av utsöndrade bakteriella toxiner på däggdjursvärdceller

Summary

Här, är en metod som använder ett permeabelt membran insert baserade infektionssystem för att studera effekterna av streptolysin S, en utsöndrad toxiner som produceras av grupp A-streptokocker, på keratinocyter beskrivits. Detta system kan lätt tillämpas på studier av andra utsöndrade bakteriella proteiner på olika typer värdcell under infektion.

Abstract

Många bakteriella patogener utsöndrar potenta gifter för att underlätta destruktion av värdvävnaden, för att initiera signalering förändringar i värdceller eller att manipulera immunsystemsvar under infektionsförloppet. Även metoder har utvecklats för att framgångsrikt rena och producera många av dessa viktiga virulensfaktorer, finns det fortfarande många bakterietoxiner vars unika struktur eller omfattande posttranslationella modifieringar gör dem svåra att rena och studera i in vitro-system. Även när rent toxin kan erhållas, det finns många utmaningar i samband med att studera de konkreta verkningarna av ett toxin enligt relevanta fysiologiska förhållanden. De flesta in vitro cellodlings modeller för att bedöma effekterna av utsöndrade bakterietoxiner på värdceller innebär inkubation värdceller med en engångs dos av toxin. Sådana metoder dåligt approximera vad värdceller faktiskt upplever under en infektion, där toxin kontinuerligt produceras avbakterieceller och tillåts ansamlas gradvis under loppet av infektion. Detta protokoll beskriver utformningen av ett membran insats baserade bakterieinfektion system för att studera effekterna av streptolysin S, en potent toxin som produceras av grupp A-streptokocker, om mänskliga epitelceller keratinocyter. Detta system härmar närmare den naturliga fysiologiska miljön under en infektion än metoder där rent toxin eller bakteriella supernatanterna direkt tillämpas på värdceller. Viktigt är denna metod eliminerar också förspänningen av värdsvar som beror på direkt kontakt mellan bakterier och värdceller. Detta system har använts för att på ett effektivt sätt bedöma effekterna av streptolysin S (SLS) på värdmembranintegritet, cellulär viabilitet och cellulära signaleringssvar. Denna teknik kan lätt användas för att studera andra utsöndrade virulensfaktorer på en mängd olika däggdjurstyper värdcellen för att undersöka specifika roll ett utsöndrat bakteriell faktor dnder infektionsförloppet.

Introduction

Förstå funktionen av bakteriella virulensfaktorer i samband med värdcellinfektion är ett stort fokus av bakteriell patogenes forskning. Många bakteriella patogener utsöndrar aktivt gifter och andra lösliga faktorer för att underlätta destruktion av värdvävnaden, för att initiera signalering förändringar i värdceller eller att manipulera immunsystemsvar under infektionsförloppet ^1-10. Även om metoder har utvecklats för att framgångsrikt rena och producera många av dessa viktiga virulensfaktorer för studier, vissa bakterieprodukter har unika strukturer eller omfattande posttranslationella modifieringar som gör dem motsträviga kandidater för reningsmetoder och därmed inte kan studeras isolerat med användning av in vitro-system . Till exempel, grupp A-streptokocker, bakteriell patogen som en myriad av infektioner som sträcker sig från faryngit till nekrotiserande fasciit och toxisk chock syndrom, producerar ett utsöndratbakterietoxin kallas streptolysin S (SLS) ^11-17. Detta ribosomally producerad peptid kodas av Streptolysin S associerade gen (sag) kluster och mogen produkt beräknas vara 2,7 kDa i storlek ^14-17. Protoxinet, som kodas av Saga, modifieras post-translationellt av flera enzymer (SagB, SagC och SAGD) för att producera den mogna, funktionella formen ^15-17. Komplexiteten i dessa posttranslationella modifieringar tillsammans med toxinet ovanliga aminosyrasekvens har gjort toxinet oförenligt med alla renings- och struktur belysning ansträngningar som har försökt hittills ^15,17. Dessa utmaningar har komplicerade arbetet med att fastställa särskilda roll denna toxin i värd patogenes.

I de fall då framställningen av renade toxiner eller andra utsöndrade faktorer är antingen komplexa eller inte möjligt, mekanismer för attbelysa funktionen hos dessa produkter har traditionellt studerats genom framställning av filtrerade bakteriella supernatanter, som sedan tillämpas på värdceller ^18-20. Det finns flera utmaningar i samband med denna teknik. Först, många av dessa utsöndrade faktorer, däribland SLS, upprätthåller inte maximal eller konsekvent aktivitet när de lagras och appliceras till värdceller vid ett senare tillfälle. Dessutom, när supernatanter samlas vid en enda tidpunkt och sedan appliceras på värdceller, är det svårt att avgöra fysiologiska relevansen och dra direkta slutsatser om den naturliga infektionsprocessen, där utsöndrade faktorer tillåts ackumuleras under infektionsförloppet till en fysiologiskt relevant koncentration. Denna andra utmaningen gäller inte bara användningen av bakteriella supernatanter, men också till användning av renade toxiner i värdcellstudier ^{1 – 3,8.} För att ta itu med dessa frågor, en membran insert-baserade infektionssystem har utvecklats för att bedöma effekterna av SLS på värdceller på ett sätt som upprätthåller optimal toxinaktivitet och även eliminerar variabel för direktkontakt mellan bakterier och värdceller. I detta system är humana epitelceller odlas i ett monoskikt i den nedre kammaren av en två kammare väl, och bakterier införs i den övre kammaren i samma brunn. Ett poröst membran (0,4 um porer) separerar de övre och nedre kamrarna, vilket gör att utsöndrade faktorer som ska utbytas mellan de två kamrarna, men förhindrar passage av bakterier. Detta system har gjort det möjligt för effektiv utvärdering av värdsvar som enbart på grund av ihållande utsöndrade bakteriella komponenter och eliminera eventuella svar som kan uppstå genom direktkontakt under grupp A-streptokockinfektion. Även om andra utsöndrade bakteriella faktorer än SLS kan också passera genom det porösa membranet, användning av en isogen mutantpanelen inklusive vildtyp (WT), en SLS-knockout (ΔsagA) och en saga kompletteras stam (ΔsagA + Saga) möjliggör noggrann utvärdering av värdsvar som är strikt SLS beroende ^21.

Även om liknande membran skärsystem har använts för att studera utsöndrade faktorer som virusinfektioner, cancerbiologi och immunceller migration ^22-26, några studier med bakteriella interaktioner med värdceller har använt denna metod ^6,27,28. Även studier som har använt sådana system för att undersöka interaktioner mellan bakterier och värdceller har främst fokuserat på migrering av inflammatoriska celler eller bakterier genom en epitel eller endotel monoskikt pläterade på membran insatsen. Det permeabla membranet insert baserade infektionssystem som beskrivs häri är en enkel och effektiv metod som förlitar sig på separation av bakterier och värdceller via ett poröst membran för att bedöma effects av utsöndrat toxin, SLS, om värdmembranintegritet, cellulär viabilitet, cellulär signaltransduktion, och utsöndrade värdcellfaktorer. Denna teknik kan anpassas till studier av andra utsöndrade virulensfaktörer på en mängd olika däggdjurstyper värdcell att undersöka rollen av en specifik bakteriell faktor under loppet av en infektion.

Protocol

1. Bakteriekultur Generera isogena mutantstammar som skall användas för att studera den specifika utsöndrade faktorn intresse 21. Obs! GASM1T1 5448 stammar som används för dessa experiment ingår WT GAS ", en saga Δ katt SLS-mutant (förkortad i text som Δ Saga), och en saga kompletteras stam (förkortat i text som Δ Saga + Saga) 21. Förbered natten flytande kulturer av bakteriestammar av intresse. Växa GAS M1T1 5448-stammar i -10 ml Todd-Hewitt-buljong vid 37 ° C under 16-20 h före infektering mänskliga celler. Centrifugera över natten bakteriekulturer (2400 RCF i 10 min) och återsuspendera i färskt bakteriellt medium. Notera: återsuspension i samma volym som de nattgamla kulturer odlades i (5-10 ml) i allmänhet ger en önskvärd initial optisk densitet. Normalisera bakteriekulturer tilllika utgångs koncentrationer genom att späda de återsuspenderade kulturer i ytterligare bakteriellt medium tills samma optiska densiteten vid 600 nm (OD 600) erhålls för alla stammar som ska testas (OD 600 av ca 1,0 rekommenderas av bekvämlighetsskäl). Notera: I dessa studier, var stationär fas bakteriekulturer användes för att infektera värdceller omedelbart efter normalisering. Men eftersom vissa bakteriestammar exit stationär fas nonsynchronously kan det vara mer lämpligt att börja värd infektioner med log fas kulturer om detta visar sig vara fallet för de stammar av intresse. Före vidare analys, utföra en koloniräkning analys för att bestämma de kolonibildande enheter (CFU) per milliliter närvarande i utgångskulturer så att mångfalden av infektion (MOI), eller förhållandet av bakterier per värdcell, kan bestämmas. Förbered 1 ml serieutspädningar av bakteriekulturer som har normaliserats till den önskade optiska Density i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller lämpligt bakteriellt tillväxtmedium (Todd-Hewitt-buljong användes i dessa studier). Förbereda utspädningar som sträcker sig från 10 -1 till 10 -6 att producera åtminstone en uppsättning av agarplattor med kolonier som kan räknas (30-300 kolonier). Utför alla utspädningar i triplikat. Överför 100 | il av varje serieutspädning på en agarplatta innehållande lämpligt medium för bakteriearten som analyseras. Notera: Todd-Hewitt-agar användes i dessa studier. Använda en glas- eller plast bakteriell spridare för att jämnt fördela 100 jil alikvot över hela ytan av det agarplatta, och fortsätta sprida tills vätskan har absorberats in i ägarn. Prestera under flamma med steril teknik. Inkubera agarplattorna vid 37 ° C över natt eller tills kolonier som kan räknas visas. Räknas kolonierna som växer på varje platta och beräkna CFU / ml i den ursprungliga kulturen med följande formula: antal kolonier x inversen av seriespäd / odlingsvolym pläterad i milliliter. t.ex. (200 kolonier x 1/10 -5 utspädning) / 0,1 ml pläterade = 2,0 x 10 8 CFU / ml 2. Värdcellkultur Erhålla en lämplig värdcellinje för de önskade analyser. Obs: HaCaT humana epitelceller keratinocyter 29, en slags gåva från V. Nizet, användes för dessa studier. Upprätthålla HaCaT-celler i 100 mm odlingsskålar i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS). Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2. 3. värdcell Infektion med membran Insert System Plate celler i lämpliga vävnadsodlingsskålar och låta dem växa tills de når 90% konfluens. Obs! HaCaT celler som används i dessa studier typiskt nå konfluens inom 2-3 days efter plätering. För lysat samling (t.ex. signaleringsanalys och adenosintrifosfat (ATP) bestämningsanalyser), plattan HaCaT-celler i 6 brunnar med en såddtäthet av ca 3 x 10 5 celler / brunn. För immunfluorescensavbildningsexperiment, tallriks celler på sterila täckglas inom 6 brunnsplattor med en såddtäthet av ca 3 x 10 5 celler / brunn. För etidium homodimer membran permeabilisering och laktatdehydrogenas (LDH) frisättningsanalyser, tallrik HaCaT-celler i 24 brunnar på en såddtäthet av ca 5 x 10 4 celler / brunn. Omedelbart före behandling, tvätta cellerna med 1x steril PBS. Tillämpa färskt tillväxtmedium till celler. För de villkor som beskrivs här, tillämpas två ml medium per brunn i 6-brunnsplattor eller 0,5 ml medium per brunn i 24-brunnsplattor. Om farmakologisk behandling testas, blanda med färskt medium och tillämpas under denna stes. Obs! Vissa analyser kan kräva alternativa medier. Till exempel, såsom fenolrött och höga serumkoncentrationer interfererar med LDH frisättningsanalys, fenolrött-fritt DMEM som kompletterats med 1% bovint serumalbumin (BSA) (vikt / volym), 2 mM L-glutamin och 1 mM natriumpyruvat var utnyttjas för dessa experiment. Efter nytt medium har tillämpats, försiktigt placera en steril 0,4 um membran insats i varje brunn. Utföra detta steg i en huv med laminärt flöde, och använda steril pincett för att överföra det permeabla membranet insatsen i varje brunn. Tillämpa färskt cellodlingsmedium till den övre kammaren av varje brunn enligt tillverkarens instruktioner. För de villkor som beskrivs här, tillämpas en ml medium per brunn i 6-brunnsplattor eller 0,1 ml medium per brunn i 24-brunnsplattor. Applicera en lämplig volym av normaliserade bakteriekulturer (se avsnitt 1) ​​till den övre kammaren av membran insatssystem. Använda bakteriellt medium för oinfekterad control behandlingar. För de resultat som beskrivs här, tillsätt 25 | il av de normaliserade kulturer per kammare för plattor med 24 brunnar och tillsätt 100 pl av kulturerna per kammare för plattor med 6 brunnar. Obs: I dessa studier var vildtyp eller mutant GAS tillämpas på värdceller vid en MOI av 10. MOI beräknades baserat på den slutliga eukaryot cell nummer (t.ex. 2 x 10 6 celler / brunn), så att 10 gånger så många bakterier tillsattes per värdcell i början av infektionen perioden (t.ex. 2 x 10 7 CFU per brunn). Lämplig MOI varierar med olika bakteriearter och med de önskade uppföljnings analyser. Obs: Förutom att använda bakterie medium för oinfekterade kontroller, andra användbara kontroller för vissa tillämpningar av denna teknik kan innefatta värmedödade bakterier eller använt bakterie medium för jämförelse. Inkubera infekterade cellerna vid 37 ° C med 5% CO2. 4. Provtagning <ol> Att samla in cellkulturmedium, värdcellysat eller täckglas av glas med intakta celler för uppföljning analyser, börjar genom att försiktigt avlägsna det permeabla membranet insatsen med steril pincett. För bedömning av utsöndrat värd Protiens: Samla mediet från den nedre kammaren in i 1,5 ml rör. Undvika att störa monoskiktet under samlingen. Centrifugera proverna vid 14000 RCF i 10 min vid 4 ° C för att avlägsna cellrester. Ta bort alla utom 50 pl av supernatanten till ett nytt 1,5 ml rör och förvara vid -20 ° C eller användas direkt. För bedömning av värdcell Lystates: aspirera försiktigt mediet ovanför monolager av värdceller. Undvika att störa mono, eftersom detta kan resultera i provförlust. Skölj cellerna en gång med 1x PBS. Försiktigt aspirera PBS. Omedelbart tillämpa en lämplig volym av iskall lysbuffert att uppnå den önskade proteinkoncentrationen, och inkuberaprover på is under 15 minuter. Gälla mellan 200 | il och 350 | il lysbuffert per brunn av varje 6-brunnsplatta för att uppnå proteinkoncentrationer mellan 0,5 och 1,5 mg / ml. Obs: lysbuffert användes i dessa studier bestod av avjoniserat vatten, 1% (volym / volym) Nonidet P40 Substitute, en fosfatas-inhibitor cocktail, och en proteasinhibitorcocktail. Specifika reagens listas i Material och utrustning avsnittet. Använda ett cellskrapa för att lösgöra cellerna från plattan ytan av varje brunn och pipettera upp hela innehållet i varje brunn i en 1,5 ml rör. Centrifugera proverna vid 14000 RCF i 20 min vid 4 C. För att bedöma lösliga lysat komponenter, avlägsna supernatanten till ett nytt rör och förvara vid -20 ° C eller användas direkt. För att bedöma nukleära eller andra olösliga lysat komponenter förbehåller pelleten och förvara vid -20 ° C eller användas direkt. För bedömning Immunofluorescens Imaging: Sompiratmediet och tvätta cellerna i 1x kall PBS. Fixera cellerna över natten i 4% paraformaldehyd (PFA) lösning i PBS (vikt / volym). Obs: I dessa studier tillsattes 1 ml av PFA sattes per brunn av varje 6-brunnsplatta. 5. Föreslagna Applications Värd Signaltransduktion Analys genom SDS-PAGE och Western blotting Samla värdcellysat som beskrivs i avsnitt 4.3. Bestämma proteinkoncentrationen i varje prov lysatet genom bicinkoninsyra (BCA) analys eller ekvivalenta med användning av proteinstandarder 30. Normalisera proteinkoncentrationer prover före lastning och köra prover på en 4-15% polyakrylamidgel eller lämpligt alternativ 31. Normalisera provkoncentrationer genom att pipettera samma proteinmängden från varje prov (t.ex. 20 mikrogram) i en ny 1,5 ml rör och tillsätta varierande volymer lysbuffert (buffertvolym = total volym – provvolymtillsatt) till varje rör för att göra den totala volymen (t.ex. 50 | j, l) och slutlig proteinkoncentration ekvivalent över prover. Överför proverna till en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (eller motsvarande). För de resultat som beskrivs här, överföra proverna vid 25 volt under 2 timmar för att sedan öka spänningen till 70 volt under ytterligare 45 min. Använda överföringsbuffert bestående av 200 mM Tris-bas, 1,5 M glycin och 20% metanol (volym / volym) i avjoniserat vatten. Blockera membran i 5% BSA + 0,1% Tween 20 i Tris-buffrad saltlösning (TBS). Justera detta baserat på tillverkarens rekommendationer för antikroppen som ska användas. Inkubera membran med primära antikroppar över natten vid 4 ° C. Användning på tillverkarens rekommenderade utspädning. Tvätta membranen i 1,5 h i TBS + 0,1% Tween 20; uppdatera buffert varje 10-15 min. Inkubera med pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerad sekundär antikropp vid en utspädning av 1: 5000 i 1,5 h vid rumstemperature. Tvätta membranen i 1,5 h i TBS + 0,1% Tween 20; förnyelsebufferten var 10 – 15 min. Inkubera membran med kemiluminescens detektionsreagens före utvecklas på film enligt tillverkarens anvisningar. Andra detekteringsmetoder kan användas såsom önskas. Värdcell immunofluorescensfärgning och Imaging Fix täck innehållande värdceller som beskrivs i avsnitt 4.4. Ta bort PFA lösning och tvätta täck innehållande behandlade celler två gånger i PBS, aspire mellan tvättar. Obs: PFA är mycket giftig och måste kasseras på lämpligt sätt. Blockera täckglasen under 2 h vid rumstemperatur i PBS med 1% (vikt / vol) normalt getserum, 2% (volym / volym) Triton X-100, och 0,5% (v / v) Tween 20. Tvätta täckglas med PBS under 30 min, uppfriskande bufferten var 10 min. Inkubera täck med primär antikropp vid en 1:50 förhållande (eller som rekommenderas av tillverkaren) i blockerande solution över natten vid 4 ° C. Tvätta täckglasen under 1,5 h i PBS, uppfriskande bufferten var 30 min. Inkubera täckglasen under 2 h vid rumstemperatur i en sekundär antikropp (get anti-kanin IgG AlexaFluor488 användes för dessa studier) med användning av en 1: 200-förhållande av antikropp till blockerande lösningen. Tvätta täck under 1 timme, uppfriskande bufferten var 20 min. Applicera önskade fläckar. Obs: Dessa studier utnyttjade DAPI (kärnkraft fläck) och rodamin-falloidin (aktin fläck) vid förhållanden av 1: 1000 i blockeringslösning. Inkubera täck med nukleära och aktin fläckar i 30 minuter vid rumstemperatur. Tvätta täckglas i PBS under 30 min vid rumstemperatur, uppdatera buffert var 10 min. Montera täck på objektglas med hjälp av monteringsmedium. Låt täck att ställa på bilderna natten före förslutning och bildbehandling. För de resultat som beskrivs här, samla bilder på ett fluorescensmikroskop USIng en standard 20X mål. Använd ImageJ och mikroskop bildbehandlingsprogram för att bearbeta de tagna bilderna. Etidium homodimer celldöd analys Aspirera medium från varje brunn och tvätta cellerna två gånger med steril PBS. Applicera 4 iM etidium homodimer-1 i PBS. Inkubera cellerna vid rumstemperatur under 30 minuter i mörker. Bestämma nivån av fluorescens med användning av en plattläsare inställd på 528 nm excitation och 617 nm emission med ett gränsvärde på 590 nm. Lägg 0,1% (vikt / volym) Saponin till varje brunn efter den initiala behandlingen och låt plattan inkubera under ytterligare 20 minuter vid rumstemperatur (med gungande) innan avläsning av plattan en andra gång vid samma inställningar. Bestämma procent membran permeabilization individuellt för varje brunn genom att dela den initiala fluorescensavläsning (efterbehandling) av den andra fluorescensavläsning (post-Saponin). ATP Bestämning Assay <li> Samla lysat som beskrivs i avsnitt 4.3 ovan. Normalisera proteinnivåer i lysaten via BCA-analys eller liknande 30. Bestäm cellulära ATP-nivåer med hjälp av en luminiscens-baserade ATP bestämningssats eller likvärdig i enlighet med tillverkarens instruktioner. Normalisera behandlade värden till motsvarande oinfekterade kontrollprover. LDH-frisättningsanalys Efter infektion, samla supernatanter som beskrivs i avsnitt 4.3. Utvärdera LDH frisättning med användning av en cytotoxicitet detekteringssats för LDH frisättning enligt tillverkarens anvisningar.

Representative Results

Det permeabla membraninsatsen baserade infektionssystem protokoll som utvecklats för studier av utsöndrade bakteriella faktorer är detaljerad i Figur 1. Systemet bygger på separation av bakterier och värdceller via ett poröst membran för att bedöma effekterna av utsöndrade bakteriella faktorer, i detta fall streptolysin S (SLS), på värdsvar såsom värd membranintegritet, cellulär viabilitet, cellulär signaltransduktion, och utsöndrade värdcellfaktorer. Figur 2 ger representativa Western Blot data som visar att detta system kan användas för att bedöma förändringar i aktiveringen av kontakt -oberoende värdsignalproteiner. Specifikt visar de representativa uppgifter avsevärt förbättrad p38 MAPK-aktivering i närvaro av SLS producerande GAS stammar. Detta system kan också tillämpas för att visualisera effekterna av utsöndrade bakteriella faktorer på värdproteinlokalisering genom immunofluorescens-mikroskopi (<strong> Figur 3). Visar uppgifterna SLS-beroende aktivering av tangenten inflammatorisk mediator Nuclear Factor kappa B (NFkB), som translokerar från cytoplasman till kärnan vid aktivering 21. Resultaten i figurerna 2 och 3 visar att både SLS-beroende inflammatoriska signaleringssvar inte kräver direkt kontakt mellan de bakterier och värdceller. Som tidigare experiment redan har visat SLS-beroende p38 och NFkB aktivering i direktinfektionsmodeller 21, liknande nivåer av p38 eller NFkB aktivering bland de tre GAS stammar i membran insatsen baserat system skulle ha indikerat att svaret krävs direktkontakt mellan bakterier och värdceller. Figur 4 visar att denna infektion system kan användas för att bedöma toxinberoende förändringar i värd cytotoxicitet via etidium homodimer och LDH frisättningsanalyser. Detta framgår av den betydande ökningen in både membran permeabilisering och i frisättningen av LDH från värdceller exponerade för GAS-stammar innehållande SLS jämfört med oinfekterade celler eller celler exponerade för SLS fattiga stammen. Dessa förändringar i cytotoxicitet inte omedelbar, eftersom signifikanta effekter är inte uppenbara förrän 12 timmar efter infektion i fallet med membran permeabilisering och 16 timmar när det gäller LDH-frisättning. De representativa data som illustrerar vikten av att välja lämpliga tidpunkter och infektionsbetingelser för utvärdering av dessa värdsvar. Förutom att låta för bedömningen av värdsignalerings förändringar och cytotoxicitet, är det permeabla membranet insatsen baserad infektion som är tillämpligt på studiet av metaboliska förändringar såsom noggrann bestämning av värd ATP-nivåer genom att förhindra bakteriell förorening av värdcellysat (figur 5) . Dessa data visar en betydande förlust av keratinocyt ATP som svar på GAS-infektion med 16 timmar efter infektion, med förbättrad ATP förlust in närvaron av SLS. Dessa resultat överensstämmer med de observerade toxinberoende ökningar i värdstresssvarssignaleringen och cytotoxicitet. Figur 1: Diagram över membran in-baserade infektion System protokoll för att bedöma effekterna av utsöndrat Bakterie faktorer på värdceller mänskliga keratinocyter pläterade i bottenutrymmet och vuxit till 90% konfluens.. En kollagen belagda membran med 0,4 um porer separerar de övre och undre kammare, och bakterier läggs till den övre kammaren av membran insatssystem för den önskade infektionsperioden. Cellodlingssupernatanter och värdceller kan samlas efter infektionen perioden och används för en mängd olika analyser. Klicka här för att se en större versionav denna siffra. Figur 2:. Det permeabla membranet Insert-Baserat Infektion systemen kan utnyttjas för Host Cell Lysate Analys genom SDS-PAGE och Western Blotting De representativa data demonstrerar att SLS förstärker aktiveringen av p38-MAPK-vägen i infekterade keratinocyter. (A) HaCaTs infekterades med gas för 7 timmar via membran insatsen infektion systemet (vid MOI = 10) och lysaten utvärderades för aktivering av p38. (B) Densitometry från tre oberoende Western-blottar utfördes för att kvantifiera den relativa aktiveringen av p38 som respons på GAS'infection. Medelvärden från tre biologiska replikat visas, med Felstaplar representerar standardavvikelse. Relativ aktivering av p38 representeras fosforylerat / total proteinnivå. Statistisk signifikans bestämdes jämfört medoinfekterade celler. Det totala p-värde bestämdes genom ANOVA (p = 0,0063). Dunnetts tester utfördes post hoc för att jämföra varje tillstånd till motsvarande oinfekterade kontrollmedelvärdet. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001 till 0,01; ***, P = 0,0001 till 0,001; ****, P <0,0001. Denna siffra har ändrats från Flaherty et al. 2015 21. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3:. Det permeabla membranet Infoga-baserade infektion system möjliggör visualisering av värdsignalera förändringar av Immunofluorescensmikroskopi De representativa data visar att streptolysin S ökar pro-inflammatoriska signal genom aktivering av NFkB. HaCaT humana keratinocyter infekterades med gas vid ett M OI av 10 under 8 h med användning av det permeabla membranet insatsen baserade infektionssystem. (A och B) Kärn lokalisering av NFkB bedömdes genom immunofluorescens avbildning. Den procentuella andelen kärn lokaliserade celler beräknades genom att räkna antalet celler i vilka NFkB hade translokerade från cytoplasman till kärnan för ett bestämt område och dividera den siffran med det totala antalet celler för samma område. Skalstrecken anger 100 | j, m. (A) i genomsnitt tre biologiska replikat representeras för varje tillstånd med Felstaplar representerar standardavvikelse. Det totala p-värde bestämdes genom ANOVA; p <0,0001. Dunnetts test genomfördes för att jämföra varje tillstånd till motsvarande oinfekterade kontrolltillstånd. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001 till 0,01; ***, P = 0,0001 till 0,001; ****, P <0,0001. Denna siffra har ändrats från Flaherty et al. 2015 21./ftp_upload/54406/54406fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 4:. Det permeabla membranet Infoga-baserade infektion system möjliggör bestämning av bakteriemedierad Membrane Permeabilization och cytotoxicitet i frånvaro av direkt kontakt mellan bakterier och värdceller De representativa data visar att keratinocyt lönsamheten minskar i närvaro av aktiva SLS toxin . GAS – inducerad celldöd utvärderades i HaCaT-celler i närvaro av WT, SLS-bristfällig eller Saga kompletteras GAS Keratinocyter exponerades för GAS använder det permeabla membranet insatsen baserade infektionssystem för 8-16 h vid en MOI av 10. (. A) viabilitet bedömdes genom etidium homodimer-analys eller (B) LDH frisättningsanalys. I båda panelerna, 3 replicates beräknas i medeltal och felstaplar representerar standardavvikelsen. Betydelse för varje tidpunkt bestämdes genom ANOVA (A) 8 tim, p = 0,0241; 12 h, p <0,0001 (B) 8 tim, p = 0,0287; 12 timmar, p = 0,1977; 16 timmar, p = 0,0031. Dunnetts test genomfördes för att jämföra medel från varje tillstånd till infektion av vildtyp för motsvarande tidpunkt. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001 till 0,01; ***, P = 0,0001 till 0,001; ****, P <0,0001. Denna siffra har ändrats från Flaherty et al. 2015 21. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 5: det permeabla membranet Infoga-baserade infektion system möjliggör noggrann bestämning av värd ATP nivåer genom att förhindra BactErial Förorening av värdcellysat. De representativa data visar SLS beroende förlust av ATP under grupp A-streptokockinfektion. HaCaT-celler infekterades med gas för 8-16 h med användning av det permeabla membranet insatsen baserade infektionssystem. Tekniska replikat (n = 3) från en representant biologiska replikat (2 x 10 6 celler per prov) var i genomsnitt för varje tillstånd, med Felstaplar representerar standardavvikelse. De övergripande p-värden bestämdes genom ANOVA (12 h, p <0,0001; 16 h, p <0,0001). Dunnetts test genomfördes för att jämföra varje tillstånd med vildtyp-infektion för motsvarande tidpunkt. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001 till 0,01; ***, P = 0,0001 till 0,001; ****, P <0,0001. Denna siffra har ändrats från Flaherty et al. 2015 21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Häri beskrivs en metod som använder en membran insats baserade infektionssystem för att undersöka effekterna av bakteriellt toxin Streptolysin S om mänskliga epitelceller keratinocyter i ett system för in vitro. Detta protokoll kan anpassas för studier av andra utsöndrade bakteriella virulensfaktorer samt alternativa typer värdcell. Detta nyligen utvecklat system ger flera fördelar jämfört med experimentella metoder som utnyttjar renade toxiner eller filtrerade bakterie supernatanter ^{1 – 3,8,18 – 20.} Det permeabla membraninsatsen baserat system ger en ständigt underhållas dos av den relevanta bakteriella toxinet till värdceller som produceras, vilket möjliggör maximal toxinaktivitet upprätthållas och ökar också överensstämmelse mellan experiment. Dessutom detta system härmar närmare fysiologiska förhållanden genom att låta den utsöndrade faktorn att ackumuleras över tiden som infektionen fortsätter och Elimiursprung behovet av att godtyckligt välja specifika toxinkoncentrationer skall tillämpas på värdceller. Dessutom skulle detta system även tillhandahålla medel för utredarna att bedöma om en bakteriell faktor av intresse levereras till värdceller i en kontaktberoende sätt. Kontakta beroende är ofta testas genom generering av isogena bakterie mutanter som saknar vidhäftning eller genom användning av reagens som förhindrar vidhäftning. Det system som beskrivs här skulle ge ett enkelt alternativ för att komplettera eller ersätta dessa traditionella metoder.

Förutom de testade program som beskrivs i avsnitt 5 i protokollet, andra program som denna infektion systemet kan lätt anpassas omfatta insamling av prover för cytokin arrayer och ELISA-analyser. I båda dessa fall kan ett liknande protokoll som beskrivits för LDH frisättningsanalyser följas. Även om det inte visas här, har detta system använts för att effektivt samla värdcellprover för att vara ennalyzed med flödescytometri. I denna ansökan, är det permeabla membranet insatsen avlägsnas efter infektionsperioden, tvättas cellerna för att avlägsna cellkulturmedium, och trypsin appliceras för att tillåta insamling av cellerna för analys. Den fysikaliska separationen av bakterier från värdceller är särskilt användbar för denna tillämpning eftersom det hjälper till att förhindra bildningen av stora aggregat som består av vidhäftade bakterier och värdceller som annars kan störa noggrann cellräkning genom flödescytometern.

Men mycket konsekventa värdsvar har observerats när man jämför resultaten av de genomträngliga membraninsatsbaserad infektionsstudier med traditionella direktinfektionsstudier har några anmärkningsvärda skillnader i kinetiken för dessa värdsvar observerats ^21. Till exempel förändringar i värd signalering och membranbaserade cytotoxicitet ta 30-50% längre tid att uppträda i membran insatsen baserad infektionsmodell än corsvara direkta infektionsmodeller. Eftersom det permeabla membranet insatsen baserat system kräver medium som skall tillämpas på de övre och nedre facken i varje brunn, det system som utvecklats för de studier som beskrivs här krävs en ökning av den totala mediumvolym 30% per brunn jämfört med motsvarande direktinfektionsmodeller använts tidigare ^21. Denna skillnad i total mediumvolym, i kombination med det ökade avståndet mellan bakterier och värdceller vid direktkontakt är förbjuden, ökar sannolikt den tid det tar för SLS att diffundera genom mediet för att nå värdceller och framkalla de observerade effekterna. Dessutom tar bort membran insatsbaserat system många GAS virulensfaktorer som kan bidra till värdcellskada; avsaknad av dessa ytterligare faktorer i detta system är också sannolikt att bidra till fördröjningen i värd celldöd och initiering av värd signalering händelser jämfört med direkt infektion ^21. Dessa faktorer bör övervägasnär man utformar experiment för att utvärdera andra utsöndrade bakteriella komponenter.

För att identifiera de mest meningsfulla förhållanden för att testa effekterna av utsöndrade bakteriella faktorer värdceller, testa en rad tidpunkter för varje tillämpning av membran insatsen baserade infektionssystem rekommenderas. Det är viktigt att tänka på vilka villkor den specifika virulensfaktor av intresse optimalt produceras (t.ex. log-fas, stationär fas, som svar på vissa signaler från omgivningen, etc.) för att framgångsrikt observera dess effekter. I experiment fokuserade på att utvärdera förändringar i värdsignalproteiner, var det nödvändigt att välja tidpunkter som tillåts tillräcklig tid för SLS att nå värdceller och produceras i tillräckliga mängder för att inducera signalering förändringar ^21. Samtidigt, för att bedöma förändringar i värd signalering behövs utföras före SLS-inducerad membran permeabilization, eftersom denna effekt complicates insamling av värdcellysat för analys. Celldöd inducerad av SLS kan optimalt observeras i både direkta och membran insatsbaserad infektionsmodeller flera timmar efter initiering av de rapporterade signaleringshändelser ^21. Dessutom, som ett val av tidpunkter av intresse, är det också viktigt att se till att bakterierna som studeras är oförmögna att penetrera den porösa insatsen membranet under studieperioden. Produktionen av vissa bakteriella komponenterna över en längre period kan störa integriteten av membranet och medge passage av bakterier till den undre avdelningen. Att avgöra om detta är ett potentiellt problem i systemet av intresse, kan de bakteriestammar som skall studeras appliceras på den övre kammaren av det permeabla membranet insatsen baserat system vid ett intervall av tidpunkterna. Vid varje tidpunkt kan insatsen tas försiktigt bort och mediet från bottenkammaren kan uppsamlas och användas i en standard koloni counting analys (se avsnitt 1.5). Om inga kolonier bildas från cellodlingsmediet i den undre avdelningen, kan insatsen membranet antas vara effektivt förhindra passage av bakterier vid tidpunkten och bakteriell belastning testas.

En annan experimentell design komponent som är sannolikt att kräva optimering för en effektiv analys av utsöndrade bakteriella faktorer är den mångfald av infektion (MOI). MOI hänför sig till förhållandet av bakterieceller per värdcell, och är därför påverkad av värdcellsammanflytning vid tidpunkten för infektion och med antalet bakteriella kolonibildande enheter (CFU) som tillämpas på cellerna. I dessa studier var keratinocytceller vuxit till 90% konfluens, vilket gjorde dessa celler för att bilda en sammanhållen monolager med intakta täta förbindelser. Omtanke av den fysiologiska organisation av värdcellerna som ska studeras är nödvändigt att välja en lämplig sammanflytning för infektion experiment. När en approprIate antal värdceller per brunn bestäms, kan en lämplig bakterie CFU beräknas bygger upp önskad MOI. I de studier som beskrivs här, GAS tillämpas på värdceller vid en MOI av 10. Lämplig MOI varierar med olika bakterier och med de önskade uppföljnings analyser. En låg början MOI är typiskt mer fysiologiskt relevant och möjliggör den bakteriella faktorn av intresse att ackumulera tillräckligt långsamt för att fånga subtila förändringar i värdcellsignalering före dramatiska förändringar i värdcellens viabilitet är uppenbara. Högre MOI användes i många studier som bedömer cytotoxicitet, men denna effekt kan också uppnås genom att börja med en låg MOI och tillåta infektionen att utvecklas under en längre tidsperiod. Det är viktigt att fastställa en exakt CFU till optisk densitet naturlig följd för alla bakteriestammar som skall testas, som isogena mutanter kan ha en förändrad tillväxthastighet jämfört med vildtyp bakterier och kan därför kräva att en högre eller lägre CFU tillsättas per brunn tillsäkerställa en lämplig jämförelse av värdsvar mellan stammar. I de fall där däggdjursvärdceller som studeras är kapabla att döda bakterier eller hämma deras tillväxt eller om man misstänker icke-synkron tillväxt mellan bakteriestammar är, kan det också vara bra att genomföra studier för att bedöma den slutliga bakteriehalten i slutet av infektionsperioden. Detta kan åstadkommas genom att samla innehållet i det genomträngliga insatsen och utför en koloniräkning analys liknande den som beskrivs i avsnitt 1.5 i förfarandet.

Välja lämpligt dimensionerade brunnar för den önskade analysen är också viktigt för att erhålla optimala resultat. Membran skär finns i olika storlekar, men de mest konsekventa resultat för studier visat här observerades med hjälp av insatser avsedda för 24 brunnar och 6 såväl vävnadsodlingsplattor. Dessa insättningsstorlekar är relativt lätta att hantera med steril pincett, och enkel manipulering är kritisk i preventing oönskad överföring av bakterier från det övre utrymmet till det undre utrymmet av brunnen. För experiment som involverar insamling av värdcellysat, 6 brunnar ger en lämplig cellantalet per förutsättning för de flesta analyser och är stor nog att rymma cellskrapor för provtagning. För cytotoxicitetsanalyser i vilket värdcellerna förblir vidhäftande och är märkta med en fluorescerande eller kolorimetrisk färgämne som kan mätas på en plattläsare (t.ex. etidium homodimer-analysen, exklusion med trypanblått), är användningen av en 24-brunnsplatta med motsvarande skär rekommenderad. För experiment där cellodlingsmediet kommer att samlas in och analyseras (t.ex. LDH-frisättning, cytokin studier) antingen 24 bra eller 6-brunnsplattor kan användas, även om de mindre brunnarna ger vanligtvis tillräcklig provvolymer för dessa analyser och minimera användningen av den nödvändiga reagens. Totalt sett är mycket mångsidig den metod och kan anpassas efter behov för att förbereda samples för många uppföljnings applikationer.

Materials

Todd-Hewitt broth	Acumedia	7161A	Use appropriate broth for bacterial species of interest.
BioSpectrometer	Eppendorf	basic model	Any UV-Vis spectrophotometer is suitable.
Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875713	Other brands are suitable.
Agar	Sigma	A1296-1kg	Other brands are suitable.
HaCaT human epithelial keratinocytes			Gift from lab of Victor Nizet.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	11995-073	Use appropriate media for cell line of interest.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biowest	S162H	Use appropriate media additives for cell line of interest.
10cm tissue culture dishes	Nunc	150350	Other brands are suitable.
6 well tissue culture dishes	CytoOne	cc7682-7506	Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert.
24 well tissue culture dishes	CytoOne	cc7682-7524	Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert.
Glass coverslips	Fisherbrand	12-541-B	These must be autoclaved prior to use for cell plating.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023
Phenol Red Free DMEM	Life Technologies	31053028	Phenol Red Free media is only required for the LDH release assay.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100
L-glutamine	Gibco	25030149	Only required to supplement cell culture media for LDH release assay.
Sodium pyruvate	Gibco	BP356100	Only required to supplement cell culture media for LDH release assay.
Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (6 well)	Corning	3540
Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (24 well)	Corning	3595
Forceps	Fisher	3120018	These must be sterilized with ethanol prior to handeling Transwell inserts.
Cell scrapers	Fisherbrand	08-100-241	These are only required for the collection of cell lysates.
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	04042-500	TOXIC.  This is only required for immunofluorescence imaging.
Bicinchoninic acid (BCA) assay kit	Pierce	23227	Other protein quantification assays may be used.
Tris-glycine 4-15% polyacrylamide gels	BioRad	4561083	Buffer system and percent polyacrylamide should be selected based on proteins of interest.
Electrophoresis cassette supplies	BioRad	1658063	Only required for Western Blotting.
Electrophoresis power supply	BioRad	1645050	Only required for Western Blotting.
Western blot transfer cassette	BioRad		Only required for Western Blotting.
Polyvinylidene (PVDF) Membrane	EMD Millipore	IPVH00010	Only required for Western Blotting.
Tween 20	Sigma	P1379-500mL
Rabbit IgG-HRP secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc2030	The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection.
Mouse IgG-HRP secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc2031	The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection.
Phospho-p38 (T180+T182) MAPK antibody	Cell Signaling	4511	Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest.
Total p38 MAPK antibody	Cell Signaling	8690	Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest.
Goat anti-rabbit IgG Alexafluor488	Molecular Probes	A-11034	Other secondary antibodies may be used for immunofluoresence imaging detection.
LumiGLO Detection Reagent	KPL	54-61-00	Only required for Western Blotting with detection on film.
Detection film	Biodot	BDB57	Only required for Western Blotting with detection on film.
DeltaVision Nikon 90i fluoresence microscope	Nikon		Other fluorescence microscopes are suitable for these analyses.
Normal goat serum	Thermo Scientific	31873
Triton X-100	Sigma	T9284-500mL
DAPI nuclear stain	Cell Signaling	4083	Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest.
Rhodamine-phalloidin actin stain	Molecular Probes	R415	Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest.
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	Only required for immunofluorescence imaging.
Ethidium homodimer 1	Molecular Probes	E1169	Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay.
Spectramax M5 Microplate Reader	Molecular Devices		Other microplate readers capable of detecting UV-vis, fluorescence and luminescence may be suitable.
Saponin	Sigma	47036-50G-F	Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay.
Molecular Probes ATP Determination Kit	Life Technologies	A22066	Other kits are likely to be suitable.
Cytotoxicity Detection Kit for LDH release	Roche	11644793001	Other kits are likely to be suitable.
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385-1L	Other suppliers are suitable.
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	78420B	Other cocktails are likely to be suitable.
SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA-free	Sigma	S8830-2TAB	Other cocktails are likely to be suitable.