Her blir en fremgangsmåte ved hjelp av en permeabel membran insert-baserte infeksjon system for å studere effektene av streptolysin S, en utskilt toksin som produseres av gruppe A streptokokker, på keratinocytter rives. Dette systemet kan lett brukes til studier av andre utskilte bakterielle proteiner på ulike vertscelletyper i løpet av infeksjon.
Mange bakterielle patogener utskille potente toksiner for å hjelpe til ødeleggelse av vertens vev, for å initiere signale forandringer i vertsceller eller for å manipulere immunsystemresponser i løpet av infeksjonen. Selv om fremgangsmåter har blitt utviklet for å kunne rense og fremstille mange av disse viktige virulensfaktorer, er det fortsatt mange bakterietoksiner som har unike struktur eller omfattende post-translasjonelle modifikasjoner som gjør dem vanskelige å rense og studere in in vitro-systemer. Videre, selv når ren toksin kan erholdes, er det mange utfordringer knyttet til å studere de spesielle virkninger av et giftstoff i henhold til aktuelle fysiologiske betingelser. De fleste in vitro cellekultur modeller designet for å vurdere virkningene av utskilte toksiner på vertsceller involverer inkubasjon vertsceller med en engangsdose av toksin. Slike metoder dårlig omtrentlig hva vertsceller faktisk opplevelse under en infeksjon, hvor toksinet er kontinuerlig produseres avbakterieceller og får samle seg gradvis i løpet av infeksjonen. Denne protokollen beskriver konstruksjonen av en permeabel membran insert-baserte bakteriell infeksjon system for å studere effektene av streptolysin S, et potent toksin som produseres av gruppe A streptokokker, på humane epitelceller keratinocytter. Dette systemet etterligner nærmere den naturlige fysiologiske miljøet under en infeksjon enn metoder hvor ren gift eller bakteriell supernatanter er direkte brukt på vertsceller. Viktigere, denne fremgangsmåten eliminerer også forspenningen av verts responser som er på grunn av direkte kontakt mellom bakterier og vertsceller. Dette systemet har vært benyttet for effektivt å vurdere virkningene av streptolysin S (SLS) for vert membranintegritet, cellulær levedyktighet, og cellulære signalresponser. Denne teknikken kan lett anvendes i studiet av andre utskilte virulensfaktorer på en rekke forskjellige pattedyrvertscelletyper for å undersøke den spesifikke rollen som et utskilt bakterie faktor during løpet av infeksjonen.
Å forstå funksjonen av bakterielle virulensfaktorer i forbindelse med vertscellen infeksjon er et stort fokus på bakteriell patogenesen forskning. Mange bakterielle patogener aktivt utskiller giftstoffer og andre oppløselige faktorer for å hjelpe til ødeleggelse av vertens vev, for å initiere signale forandringer i vertsceller eller for å manipulere immunsystemresponser i løpet av infeksjonen 1 – 10. Selv om fremgangsmåter har blitt utviklet for å kunne rense og fremstille mange av disse viktige virulensfaktorer for studier, bakterielle produkter har unike strukturer eller omfattende post-translasjonelle modifikasjoner som gjør dem gjenstridige kandidater for rensemetoder, og således ikke kan studeres isolert ved hjelp av in vitro-systemene . For eksempel, gruppe A streptokokker, bakteriell patogen ansvarlig for en myriade av infeksjoner som spenner fra faryngitt til nekrotiserende fasciitt og toksisk sjokksyndrom, produserer en utskiltbakteriell toxin kjent som streptolysin S (SLS) 11-17. Dette ribosomally produsert peptidet blir kodet for av den streptolysin S forbundet gen (SAG) klynge, og det modne produkt er anslått til å være 2,7 kDa i størrelse 14-17. Den protoxin, kodet av Saga, er endret etter translatorisk av flere enzymer (SagB, SagC, og SAGD) å produsere modne, funksjonelle skjema 15-17. Kompleksiteten i disse posttranslasjonelle modifikasjoner kombinert med gift uvanlige aminosyresekvens har gjort toksinet uforenlig med alle rensing og strukturoppklaring innsatsen som er forsøkt å date 15,17. Disse utfordringene har kompliserte arbeidet med å fastslå den spesifikke rollen dette toksinet i verts patogenesen.
I de tilfeller hvor fremstillingen av rensede giftstoffer eller andre faktorer utskilles enten er kompliserte eller ikke er mulig, mekanismer for åklargjøre funksjonen av disse produktene har vært undersøkt ved fremstillingen av filtrerte bakterielle supernatanter, som deretter brukes til vertsceller 18 – 20. Det er flere utfordringer knyttet til denne teknikken. For det første er det mange av disse utskilte faktorer, blant annet SLS, ikke opprettholde maksimal eller konsistent aktivitet når de lagres og anvendes på vertsceller på et senere tidspunkt. I tillegg, når supernatanter er samlet ved et enkelt tidspunkt og deretter brukt til vertsceller, er det vanskelig å bestemme fysiologiske relevans og til å trekke direkte slutninger om den naturlige infeksjonsprosessen, hvor utskilte faktorer får lov til å hope seg opp i løpet av infeksjonen til en fysiologisk relevant konsentrasjon. Dette andre mål kan anvendes ikke bare bruken av bakterielle supernatanter, men også til bruk av rensede giftstoffer i vertscellestudier 1 – 3,8. For å løse disse problemene, en gjennomtrengelig membran insert-baserte system-infeksjon har blitt utviklet for å vurdere virkningene av SLS på vertsceller på en måte som opprettholder optimal toxin-aktivitet og også eliminerer den variable av direkte kontakt mellom bakterier og vertsceller. I dette systemet blir humane epitelceller dyrket i et monolag på den nederste kammer i en to-kammer brønn, og bakterier innføres i det øvre kammer i den samme brønnen. En porøs membran (0,4 pm porer) separerer øvre og nedre kammere, slik at utskilling av faktorer som skal utveksles mellom de to kamre, men hindrer passering av bakterier. Dette systemet har tillatt for effektiv evaluering av vertsresponser som er utelukkende på grunn av vedvarende utskilles bakterielle komponenter samtidig eliminere eventuelle svar som kan oppstå ved direkte kontakt i løpet av gruppe A-streptokokker infeksjon. Selv om andre utskilte bakterielle faktorer enn SLS kan også passere gjennom den porøse membranen, bruk av en isogen mutant panel inkluderer villtype (WT), en SLS-knockout (ΔsagA) og en Saga suppleres stamme (ΔsagA + Saga) gir presis evaluering av vertsresponser som er strengt SLS avhengige 21.
Selv om lignende permeable membran innleggs systemer har blitt ansatt for studiet av utskilt faktorer involvert i virale infeksjoner, kreft biologi, og immuncellemigrasjon 22-26, noen få studier med bakterielle interaksjoner med vertsceller har benyttet denne tilnærmingen 6,27,28. Selv studier som har benyttet slike systemer for å utforske samspillet mellom bakterier og vertsceller har primært fokusert på migrasjon av betennelsesceller eller bakterier gjennom en epitelial eller endothelial mono belagt på gjennomtrengelig membran innsatsen. Den gjennomtrengelige membran insert-baserte infeksjon systemet beskrevet heri er en enkel og effektiv metode som baserer seg på separasjon av bakterier og vertsceller ved hjelp av en porøs membran for å vurdere effeCTS av det utskilte toksin, SLS, på verten membran integritet, cellular levedyktighet, signaloverføring, og utskilling av vertscelle faktorer. Denne teknikk kan tilpasses til studiet av andre utskilte virulensfaktorer på en rekke forskjellige pattedyrvertscelletyper for å undersøke rollen til en spesifikk bakterie faktor i løpet av en infeksjon.
Heri beskrives en fremgangsmåte ved hjelp av en permeabel membran insert-baserte infeksjon system for å undersøke effekten av det bakterielle toksin streptolysin S på humane epitelceller keratinocytter i et in vitro system. Denne protokollen kan tilpasses for å studere andre utskilte bakterie virulensfaktorer, så vel som alternative vertscelletyper. Dette nylig utviklet system gir flere fordeler i forhold til eksperimentelle metoder som benytter rensede toksiner eller filtrerte bakterielle supernatanter 1 – 3,8,18 – 20. Den gjennomtrengelige membran insert-basert system gir en kontinuerlig opprettholdt dose av den relevante bakterielle toksin vertsceller som det produseres, noe som gir maksimal toksin aktivitet opprettholdes og øker også konsistens mellom eksperimenter. I tillegg er dette systemet etterligner nærmere fysiologiske tilstander ved å la det utskilte faktor for å hope seg opp over tid som infeksjonen utvikler seg og ved å eliminator for behovet for å vilkårlig velge bestemte giftkonsentrasjoner skal gjelde for vertsceller. Videre vil dette systemet også tilveiebringe midler for å undersøkere å vurdere hvorvidt en bakteriell faktor av interesse blir levert til vertsceller i en kontakt-avhengig måte. Kontakt-avhengighet er ofte testet ved generering av isogene bakterielle mutanter som mangler i tilslutning eller ved bruk av reagenser som hindrer tilslutning. Systemet som er beskrevet her ville gi en enkelt alternativ for å komplettere eller erstatte disse tradisjonelle tilnærminger.
I tillegg til de testede programmene som er beskrevet i kapittel 5 i protokollen, andre programmer som denne infeksjonen systemet kan enkelt tilpasses omfatter innsamling av prøver for cytokin arrays og ELISA-analyser. I begge disse tilfeller kan en lignende protokoll som den beskrevet for LDH-frigivelse analyser følges. Selv om det ikke er vist her, har dette systemet er benyttet for effektivt å samle vertscelleprøver for å være ennalyzed ved strømningscytometri. I denne anvendelse blir permeabel membran innsatsen fjernes etter infeksjonen perioden blir cellene vasket for å fjerne cellekulturmedium, og trypsin er påført for å tillate samling av cellene for analyse. Den fysiske separasjon av bakterier fra vertsceller som er spesielt nyttig for denne anvendelse fordi det bidrar til å hindre dannelsen av store aggregater som består av adherert bakterier og vertsceller som ellers kunne forstyrre riktig celletelling etter den flowcytometer.
Selv om svært konsistente vertsresponser er observert når man sammenligner resultatene av permeable membran innsatsbasert infeksjonsstudier med tradisjonelle direkte infeksjonsstudier, har noen bemerkelsesverdige forskjeller i kinetikk av disse vertsresponser observert 21. For eksempel, endringer i signalisering vert og membran-baserte cytotoksisitet tar 30-50% lengre tid til å oppstå i den permeable membran innsatsen basert infeksjonsmodell enn corsvarer direkte smittemodeller. Fordi den permeable membran innsatsen basert system krever at mediet som skal anvendes på de øvre og nedre kammere i hver brønn, systemet er utviklet for de som er beskrevet her studiene kreves en 30% økning i den totale medium volum per brønn sammenlignet med tilsvarende direkte infeksjonsmodeller anvendes tidligere 21. Denne forskjellen i total volum medium, kombinert med den økte avstanden mellom bakterier og vertsceller ved direkte kontakt er forbudt, øker sannsynligvis den tid det tar for SLS til å diffundere gjennom mediet for å nå vertsceller og fremkalle de observerte effekter. Dessuten fjerner den permeable membran innsatsen basert system mange GAS virulensfaktorer som sannsynligvis vil bidra til å være vert for celleskade; fravær av disse ytterligere faktorer i dette systemet er også sannsynlig å bidra til forsinkelsen i verts celledød og initiering av vertsignaleringshendelser sammenlignet med direkte infeksjon 21. Disse faktorene bør tas i betraktningved utforming eksperimenter for å vurdere andre utskilte bakterielle komponenter.
For å identifisere de mest meningsfulle forhold for å teste effekten av utskilt bakterielle faktorer på vertsceller, teste en rekke tidspunkter for hvert program av gjennomtrengelig membran insert-basert infeksjon system anbefales. Det er viktig å vurdere under hvilke forhold den spesifikke virulens faktor av interesse blir optimalt stilles (for eksempel log fase, stasjonær fase, som reaksjon på visse miljøsignaler, etc.) for å kunne observere dens virkninger. I forsøk fokusert på å vurdere endringer i verts signaliserer proteiner, var det nødvendig å velge tidspunkter som tillatt tilstrekkelig tid for SLS å nå vertsceller og skal produseres i tilstrekkelige mengder til å indusere signale endringer 21. På samme tid, vurdering av forandringer i vertssignalering som trengs for å bli utført før SLS-indusert membran permeabilization, da denne effekten complicates samling av vertscellelysatene for analyse. Celledød indusert av SLS kan bli optimalt observert i både direkte og permeabel membran innsatsbasert infeksjonsmodeller flere timer etter initiering av de rapporterte signaleringshendelser 21. Videre i å velge tids interessante, er det også viktig å sørge for at bakteriene blir undersøkt er ute av stand til å trenge gjennom den porøse innsatsen membranen under studietiden. Produksjonen av visse bakterielle komponenter over en lengre periode kan forstyrre integriteten av membranen og tillate passasje av bakterier til det nedre kammer. For å bestemme hvorvidt dette er et potensielt problem i systemet av interesse, kan de bakteriestammer som skal studeres påføres det øvre kammer av den permeable membran insert-basert system ved en rekke tidspunkter. Ved hvert tidspunkt, kan innsatsen være forsiktig fjernet og mediet fra bunnkammeret kan samles og brukes i en standard koloni cobokføring analysen (se avsnitt 1.5). Hvis ingen kolonier dannet fra cellekulturmediet i det nedre kammer, kan innsatsen membranen antas å bli effektivt hindre passering av bakterier på tidspunktet og bakteriemengden testet.
En annen eksperimentell design komponent som er egnet til å kreve optimalisering for effektiv analyse av utskilt bakterielle faktorer er den infeksjonsmultiplisitet (MOI). MOI henviser til forholdet av bakterieceller pr vertscelle, og påvirkes derfor av vertscellen konfluens på tidspunktet for infeksjon og med antall bakteriekolonidannende enheter (CFU) påført til cellene. I disse studiene, ble keratinocytt-celler dyrket til 90% konfluens, som tillater disse celler til å danne et sammenhengende monolag med intakte tett veikryss. Tenkt vurdering av den fysiologiske organiseringen av vertsceller som skal studeres er nødvendig å velge en passende konfluens for smitteforsøk. Når en approprIate antall vertsceller per brønn er bestemt, kan en passende bakteriell CFU beregnes basert utenfor ønsket MOI. I de beskrevne her studiene ble GAS påført på vertsceller ved en MOI på 10. Passende MOI vil variere med ulike bakterier og med de ønskede oppfølgingsanalyser. En lav MOI begynnelse er vanligvis mer fysiologisk relevant og gjør det mulig for den bakterielle faktor av interesse å akkumulere langsomt nok til å fange opp subtile endringer i vertscellesignalisering før dramatiske endringer i vertscellelevedyktigheten er åpenbare. Høyere mois er brukt i mange studier for vurdering av cytotoksisitet, men denne effekten kan også oppnås ved å begynne med en lav MOI, og at infeksjonen til fremgang for en lengre periode. Det er viktig å bestemme en nøyaktig CFU til tetthet konsekvens optisk for alle bakteriestammer som skal testes, som isogene mutanter kan ha en endret veksthastighet sammenlignet med villtype bakterier og kan derfor kreve at en høyere eller lavere CFU tilsettes per brønn tilsørge for en hensiktsmessig sammenligning av vertens respons mellom stammene. I de tilfeller hvor pattedyrvertsceller blir undersøkt er i stand til å drepe bakterier eller hemmer deres vekst eller dersom det er mistanke om nonsynchronous vekst mellom bakteriestammer, kan det også være nyttig å utføre studier for å vurdere den endelige bakteriemengden ved slutten av infeksjonen perioden. Dette kan oppnås ved å samle innholdet i den gjennomtrengelige innsatsen og utføre en kolonitelling analyse tilsvarende den som er beskrevet i avsnitt 1.5 av prosedyren.
Valg av passende størrelse brønner for den ønskede analysen er også viktig for å oppnå optimale resultater. Permeabel membran innsatser er tilgjengelige i en rekke størrelser, men de mest konsistente resultatene for de som er vist her studier ble observert ved bruk av innsatser er utformet for 24 brønn og 6 brønners vevskulturplater. Disse innleggs størrelsene er forholdsvis lett å håndtere med steril pinsett, og lett manipulering er kritisk i forebyggeing uønsket overføring av bakterier fra det øvre kammer til det nedre rom av brønnen. For forsøk med innsamling av vertscellelysatene, 6 vel retter gi en passende celle nummer per tilstand for de fleste analyser og er store nok til å romme celleskraper for prøvetaking. For cytotoksisitetsanalyser hvori vertscellene forblir adherent og er merket med en fluorescerende eller colorometric fargestoff som kan måles på en plateavleser (f.eks etidium homodimer assay trypan blå eksklusjon assay), er anvendelse av en 24 brønns plate med de tilsvarende innsatser anbefales. For eksperimenter hvor cellekulturmedium vil bli samlet og analysert (f.eks LDH-frigivelse, cytokin-studier), enten den 24 brønnen eller 6-brønners plater kan anvendes, selv om de mindre brønnene vanligvis gi tilstrekkelig prøvevolumer for disse analysene og minimalisere bruken av de nødvendige reagenser. Totalt sett er metoden svært allsidig og kan tilpasses etter behov for å forberede samples for mange oppfølgingsprogrammer.
The authors have nothing to disclose.
We thank our fellow Lee Lab colleagues, who provided valuable insight and expertise that greatly assisted this research. This work was supported by the Young Innovator Award from the National Institute of Health, awarded to S.W. Lee (NIH-1DP2OD008468-01). R.A. Flaherty is supported by the Albertus Magnus Fellowship provided by Dr. Robert C. Boguslaski, and a teaching assistantship through the Eck Institute for Global Health at the University of Notre Dame.
Todd-Hewitt broth | Acumedia | 7161A | Use appropriate broth for bacterial species of interest. |
BioSpectrometer | Eppendorf | basic model | Any UV-Vis spectrophotometer is suitable. |
Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Other brands are suitable. |
Agar | Sigma | A1296-1kg | Other brands are suitable. |
HaCaT human epithelial keratinocytes | Gift from lab of Victor Nizet. | ||
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | Use appropriate media for cell line of interest. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S162H | Use appropriate media additives for cell line of interest. |
10cm tissue culture dishes | Nunc | 150350 | Other brands are suitable. |
6 well tissue culture dishes | CytoOne | cc7682-7506 | Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert. |
24 well tissue culture dishes | CytoOne | cc7682-7524 | Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert. |
Glass coverslips | Fisherbrand | 12-541-B | These must be autoclaved prior to use for cell plating. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
Phenol Red Free DMEM | Life Technologies | 31053028 | Phenol Red Free media is only required for the LDH release assay. |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
L-glutamine | Gibco | 25030149 | Only required to supplement cell culture media for LDH release assay. |
Sodium pyruvate | Gibco | BP356100 | Only required to supplement cell culture media for LDH release assay. |
Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (6 well) | Corning | 3540 | |
Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (24 well) | Corning | 3595 | |
Forceps | Fisher | 3120018 | These must be sterilized with ethanol prior to handeling Transwell inserts. |
Cell scrapers | Fisherbrand | 08-100-241 | These are only required for the collection of cell lysates. |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | TOXIC. This is only required for immunofluorescence imaging. |
Bicinchoninic acid (BCA) assay kit | Pierce | 23227 | Other protein quantification assays may be used. |
Tris-glycine 4-15% polyacrylamide gels | BioRad | 4561083 | Buffer system and percent polyacrylamide should be selected based on proteins of interest. |
Electrophoresis cassette supplies | BioRad | 1658063 | Only required for Western Blotting. |
Electrophoresis power supply | BioRad | 1645050 | Only required for Western Blotting. |
Western blot transfer cassette | BioRad | Only required for Western Blotting. | |
Polyvinylidene (PVDF) Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | Only required for Western Blotting. |
Tween 20 | Sigma | P1379-500mL | |
Rabbit IgG-HRP secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc2030 | The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. |
Mouse IgG-HRP secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc2031 | The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. |
Phospho-p38 (T180+T182) MAPK antibody | Cell Signaling | 4511 | Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest. |
Total p38 MAPK antibody | Cell Signaling | 8690 | Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest. |
Goat anti-rabbit IgG Alexafluor488 | Molecular Probes | A-11034 | Other secondary antibodies may be used for immunofluoresence imaging detection. |
LumiGLO Detection Reagent | KPL | 54-61-00 | Only required for Western Blotting with detection on film. |
Detection film | Biodot | BDB57 | Only required for Western Blotting with detection on film. |
DeltaVision Nikon 90i fluoresence microscope | Nikon | Other fluorescence microscopes are suitable for these analyses. | |
Normal goat serum | Thermo Scientific | 31873 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284-500mL | |
DAPI nuclear stain | Cell Signaling | 4083 | Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest. |
Rhodamine-phalloidin actin stain | Molecular Probes | R415 | Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest. |
Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Only required for immunofluorescence imaging. |
Ethidium homodimer 1 | Molecular Probes | E1169 | Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay. |
Spectramax M5 Microplate Reader | Molecular Devices | Other microplate readers capable of detecting UV-vis, fluorescence and luminescence may be suitable. | |
Saponin | Sigma | 47036-50G-F | Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay. |
Molecular Probes ATP Determination Kit | Life Technologies | A22066 | Other kits are likely to be suitable. |
Cytotoxicity Detection Kit for LDH release | Roche | 11644793001 | Other kits are likely to be suitable. |
Nonidet P40 Substitute | Sigma | 74385-1L | Other suppliers are suitable. |
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420B | Other cocktails are likely to be suitable. |
SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA-free | Sigma | S8830-2TAB | Other cocktails are likely to be suitable. |