Här, är en metod som använder ett permeabelt membran insert baserade infektionssystem för att studera effekterna av streptolysin S, en utsöndrad toxiner som produceras av grupp A-streptokocker, på keratinocyter beskrivits. Detta system kan lätt tillämpas på studier av andra utsöndrade bakteriella proteiner på olika typer värdcell under infektion.
Många bakteriella patogener utsöndrar potenta gifter för att underlätta destruktion av värdvävnaden, för att initiera signalering förändringar i värdceller eller att manipulera immunsystemsvar under infektionsförloppet. Även metoder har utvecklats för att framgångsrikt rena och producera många av dessa viktiga virulensfaktorer, finns det fortfarande många bakterietoxiner vars unika struktur eller omfattande posttranslationella modifieringar gör dem svåra att rena och studera i in vitro-system. Även när rent toxin kan erhållas, det finns många utmaningar i samband med att studera de konkreta verkningarna av ett toxin enligt relevanta fysiologiska förhållanden. De flesta in vitro cellodlings modeller för att bedöma effekterna av utsöndrade bakterietoxiner på värdceller innebär inkubation värdceller med en engångs dos av toxin. Sådana metoder dåligt approximera vad värdceller faktiskt upplever under en infektion, där toxin kontinuerligt produceras avbakterieceller och tillåts ansamlas gradvis under loppet av infektion. Detta protokoll beskriver utformningen av ett membran insats baserade bakterieinfektion system för att studera effekterna av streptolysin S, en potent toxin som produceras av grupp A-streptokocker, om mänskliga epitelceller keratinocyter. Detta system härmar närmare den naturliga fysiologiska miljön under en infektion än metoder där rent toxin eller bakteriella supernatanterna direkt tillämpas på värdceller. Viktigt är denna metod eliminerar också förspänningen av värdsvar som beror på direkt kontakt mellan bakterier och värdceller. Detta system har använts för att på ett effektivt sätt bedöma effekterna av streptolysin S (SLS) på värdmembranintegritet, cellulär viabilitet och cellulära signaleringssvar. Denna teknik kan lätt användas för att studera andra utsöndrade virulensfaktorer på en mängd olika däggdjurstyper värdcellen för att undersöka specifika roll ett utsöndrat bakteriell faktor dnder infektionsförloppet.
Förstå funktionen av bakteriella virulensfaktorer i samband med värdcellinfektion är ett stort fokus av bakteriell patogenes forskning. Många bakteriella patogener utsöndrar aktivt gifter och andra lösliga faktorer för att underlätta destruktion av värdvävnaden, för att initiera signalering förändringar i värdceller eller att manipulera immunsystemsvar under infektionsförloppet 1-10. Även om metoder har utvecklats för att framgångsrikt rena och producera många av dessa viktiga virulensfaktorer för studier, vissa bakterieprodukter har unika strukturer eller omfattande posttranslationella modifieringar som gör dem motsträviga kandidater för reningsmetoder och därmed inte kan studeras isolerat med användning av in vitro-system . Till exempel, grupp A-streptokocker, bakteriell patogen som en myriad av infektioner som sträcker sig från faryngit till nekrotiserande fasciit och toxisk chock syndrom, producerar ett utsöndratbakterietoxin kallas streptolysin S (SLS) 11-17. Detta ribosomally producerad peptid kodas av Streptolysin S associerade gen (sag) kluster och mogen produkt beräknas vara 2,7 kDa i storlek 14-17. Protoxinet, som kodas av Saga, modifieras post-translationellt av flera enzymer (SagB, SagC och SAGD) för att producera den mogna, funktionella formen 15-17. Komplexiteten i dessa posttranslationella modifieringar tillsammans med toxinet ovanliga aminosyrasekvens har gjort toxinet oförenligt med alla renings- och struktur belysning ansträngningar som har försökt hittills 15,17. Dessa utmaningar har komplicerade arbetet med att fastställa särskilda roll denna toxin i värd patogenes.
I de fall då framställningen av renade toxiner eller andra utsöndrade faktorer är antingen komplexa eller inte möjligt, mekanismer för attbelysa funktionen hos dessa produkter har traditionellt studerats genom framställning av filtrerade bakteriella supernatanter, som sedan tillämpas på värdceller 18-20. Det finns flera utmaningar i samband med denna teknik. Först, många av dessa utsöndrade faktorer, däribland SLS, upprätthåller inte maximal eller konsekvent aktivitet när de lagras och appliceras till värdceller vid ett senare tillfälle. Dessutom, när supernatanter samlas vid en enda tidpunkt och sedan appliceras på värdceller, är det svårt att avgöra fysiologiska relevansen och dra direkta slutsatser om den naturliga infektionsprocessen, där utsöndrade faktorer tillåts ackumuleras under infektionsförloppet till en fysiologiskt relevant koncentration. Denna andra utmaningen gäller inte bara användningen av bakteriella supernatanter, men också till användning av renade toxiner i värdcellstudier 1 – 3,8. För att ta itu med dessa frågor, en membran insert-baserade infektionssystem har utvecklats för att bedöma effekterna av SLS på värdceller på ett sätt som upprätthåller optimal toxinaktivitet och även eliminerar variabel för direktkontakt mellan bakterier och värdceller. I detta system är humana epitelceller odlas i ett monoskikt i den nedre kammaren av en två kammare väl, och bakterier införs i den övre kammaren i samma brunn. Ett poröst membran (0,4 um porer) separerar de övre och nedre kamrarna, vilket gör att utsöndrade faktorer som ska utbytas mellan de två kamrarna, men förhindrar passage av bakterier. Detta system har gjort det möjligt för effektiv utvärdering av värdsvar som enbart på grund av ihållande utsöndrade bakteriella komponenter och eliminera eventuella svar som kan uppstå genom direktkontakt under grupp A-streptokockinfektion. Även om andra utsöndrade bakteriella faktorer än SLS kan också passera genom det porösa membranet, användning av en isogen mutantpanelen inklusive vildtyp (WT), en SLS-knockout (ΔsagA) och en saga kompletteras stam (ΔsagA + Saga) möjliggör noggrann utvärdering av värdsvar som är strikt SLS beroende 21.
Även om liknande membran skärsystem har använts för att studera utsöndrade faktorer som virusinfektioner, cancerbiologi och immunceller migration 22-26, några studier med bakteriella interaktioner med värdceller har använt denna metod 6,27,28. Även studier som har använt sådana system för att undersöka interaktioner mellan bakterier och värdceller har främst fokuserat på migrering av inflammatoriska celler eller bakterier genom en epitel eller endotel monoskikt pläterade på membran insatsen. Det permeabla membranet insert baserade infektionssystem som beskrivs häri är en enkel och effektiv metod som förlitar sig på separation av bakterier och värdceller via ett poröst membran för att bedöma effects av utsöndrat toxin, SLS, om värdmembranintegritet, cellulär viabilitet, cellulär signaltransduktion, och utsöndrade värdcellfaktorer. Denna teknik kan anpassas till studier av andra utsöndrade virulensfaktörer på en mängd olika däggdjurstyper värdcell att undersöka rollen av en specifik bakteriell faktor under loppet av en infektion.
Häri beskrivs en metod som använder en membran insats baserade infektionssystem för att undersöka effekterna av bakteriellt toxin Streptolysin S om mänskliga epitelceller keratinocyter i ett system för in vitro. Detta protokoll kan anpassas för studier av andra utsöndrade bakteriella virulensfaktorer samt alternativa typer värdcell. Detta nyligen utvecklat system ger flera fördelar jämfört med experimentella metoder som utnyttjar renade toxiner eller filtrerade bakterie supernatanter 1 – 3,8,18 – 20. Det permeabla membraninsatsen baserat system ger en ständigt underhållas dos av den relevanta bakteriella toxinet till värdceller som produceras, vilket möjliggör maximal toxinaktivitet upprätthållas och ökar också överensstämmelse mellan experiment. Dessutom detta system härmar närmare fysiologiska förhållanden genom att låta den utsöndrade faktorn att ackumuleras över tiden som infektionen fortsätter och Elimiursprung behovet av att godtyckligt välja specifika toxinkoncentrationer skall tillämpas på värdceller. Dessutom skulle detta system även tillhandahålla medel för utredarna att bedöma om en bakteriell faktor av intresse levereras till värdceller i en kontaktberoende sätt. Kontakta beroende är ofta testas genom generering av isogena bakterie mutanter som saknar vidhäftning eller genom användning av reagens som förhindrar vidhäftning. Det system som beskrivs här skulle ge ett enkelt alternativ för att komplettera eller ersätta dessa traditionella metoder.
Förutom de testade program som beskrivs i avsnitt 5 i protokollet, andra program som denna infektion systemet kan lätt anpassas omfatta insamling av prover för cytokin arrayer och ELISA-analyser. I båda dessa fall kan ett liknande protokoll som beskrivits för LDH frisättningsanalyser följas. Även om det inte visas här, har detta system använts för att effektivt samla värdcellprover för att vara ennalyzed med flödescytometri. I denna ansökan, är det permeabla membranet insatsen avlägsnas efter infektionsperioden, tvättas cellerna för att avlägsna cellkulturmedium, och trypsin appliceras för att tillåta insamling av cellerna för analys. Den fysikaliska separationen av bakterier från värdceller är särskilt användbar för denna tillämpning eftersom det hjälper till att förhindra bildningen av stora aggregat som består av vidhäftade bakterier och värdceller som annars kan störa noggrann cellräkning genom flödescytometern.
Men mycket konsekventa värdsvar har observerats när man jämför resultaten av de genomträngliga membraninsatsbaserad infektionsstudier med traditionella direktinfektionsstudier har några anmärkningsvärda skillnader i kinetiken för dessa värdsvar observerats 21. Till exempel förändringar i värd signalering och membranbaserade cytotoxicitet ta 30-50% längre tid att uppträda i membran insatsen baserad infektionsmodell än corsvara direkta infektionsmodeller. Eftersom det permeabla membranet insatsen baserat system kräver medium som skall tillämpas på de övre och nedre facken i varje brunn, det system som utvecklats för de studier som beskrivs här krävs en ökning av den totala mediumvolym 30% per brunn jämfört med motsvarande direktinfektionsmodeller använts tidigare 21. Denna skillnad i total mediumvolym, i kombination med det ökade avståndet mellan bakterier och värdceller vid direktkontakt är förbjuden, ökar sannolikt den tid det tar för SLS att diffundera genom mediet för att nå värdceller och framkalla de observerade effekterna. Dessutom tar bort membran insatsbaserat system många GAS virulensfaktorer som kan bidra till värdcellskada; avsaknad av dessa ytterligare faktorer i detta system är också sannolikt att bidra till fördröjningen i värd celldöd och initiering av värd signalering händelser jämfört med direkt infektion 21. Dessa faktorer bör övervägasnär man utformar experiment för att utvärdera andra utsöndrade bakteriella komponenter.
För att identifiera de mest meningsfulla förhållanden för att testa effekterna av utsöndrade bakteriella faktorer värdceller, testa en rad tidpunkter för varje tillämpning av membran insatsen baserade infektionssystem rekommenderas. Det är viktigt att tänka på vilka villkor den specifika virulensfaktor av intresse optimalt produceras (t.ex. log-fas, stationär fas, som svar på vissa signaler från omgivningen, etc.) för att framgångsrikt observera dess effekter. I experiment fokuserade på att utvärdera förändringar i värdsignalproteiner, var det nödvändigt att välja tidpunkter som tillåts tillräcklig tid för SLS att nå värdceller och produceras i tillräckliga mängder för att inducera signalering förändringar 21. Samtidigt, för att bedöma förändringar i värd signalering behövs utföras före SLS-inducerad membran permeabilization, eftersom denna effekt complicates insamling av värdcellysat för analys. Celldöd inducerad av SLS kan optimalt observeras i både direkta och membran insatsbaserad infektionsmodeller flera timmar efter initiering av de rapporterade signaleringshändelser 21. Dessutom, som ett val av tidpunkter av intresse, är det också viktigt att se till att bakterierna som studeras är oförmögna att penetrera den porösa insatsen membranet under studieperioden. Produktionen av vissa bakteriella komponenterna över en längre period kan störa integriteten av membranet och medge passage av bakterier till den undre avdelningen. Att avgöra om detta är ett potentiellt problem i systemet av intresse, kan de bakteriestammar som skall studeras appliceras på den övre kammaren av det permeabla membranet insatsen baserat system vid ett intervall av tidpunkterna. Vid varje tidpunkt kan insatsen tas försiktigt bort och mediet från bottenkammaren kan uppsamlas och användas i en standard koloni counting analys (se avsnitt 1.5). Om inga kolonier bildas från cellodlingsmediet i den undre avdelningen, kan insatsen membranet antas vara effektivt förhindra passage av bakterier vid tidpunkten och bakteriell belastning testas.
En annan experimentell design komponent som är sannolikt att kräva optimering för en effektiv analys av utsöndrade bakteriella faktorer är den mångfald av infektion (MOI). MOI hänför sig till förhållandet av bakterieceller per värdcell, och är därför påverkad av värdcellsammanflytning vid tidpunkten för infektion och med antalet bakteriella kolonibildande enheter (CFU) som tillämpas på cellerna. I dessa studier var keratinocytceller vuxit till 90% konfluens, vilket gjorde dessa celler för att bilda en sammanhållen monolager med intakta täta förbindelser. Omtanke av den fysiologiska organisation av värdcellerna som ska studeras är nödvändigt att välja en lämplig sammanflytning för infektion experiment. När en approprIate antal värdceller per brunn bestäms, kan en lämplig bakterie CFU beräknas bygger upp önskad MOI. I de studier som beskrivs här, GAS tillämpas på värdceller vid en MOI av 10. Lämplig MOI varierar med olika bakterier och med de önskade uppföljnings analyser. En låg början MOI är typiskt mer fysiologiskt relevant och möjliggör den bakteriella faktorn av intresse att ackumulera tillräckligt långsamt för att fånga subtila förändringar i värdcellsignalering före dramatiska förändringar i värdcellens viabilitet är uppenbara. Högre MOI användes i många studier som bedömer cytotoxicitet, men denna effekt kan också uppnås genom att börja med en låg MOI och tillåta infektionen att utvecklas under en längre tidsperiod. Det är viktigt att fastställa en exakt CFU till optisk densitet naturlig följd för alla bakteriestammar som skall testas, som isogena mutanter kan ha en förändrad tillväxthastighet jämfört med vildtyp bakterier och kan därför kräva att en högre eller lägre CFU tillsättas per brunn tillsäkerställa en lämplig jämförelse av värdsvar mellan stammar. I de fall där däggdjursvärdceller som studeras är kapabla att döda bakterier eller hämma deras tillväxt eller om man misstänker icke-synkron tillväxt mellan bakteriestammar är, kan det också vara bra att genomföra studier för att bedöma den slutliga bakteriehalten i slutet av infektionsperioden. Detta kan åstadkommas genom att samla innehållet i det genomträngliga insatsen och utför en koloniräkning analys liknande den som beskrivs i avsnitt 1.5 i förfarandet.
Välja lämpligt dimensionerade brunnar för den önskade analysen är också viktigt för att erhålla optimala resultat. Membran skär finns i olika storlekar, men de mest konsekventa resultat för studier visat här observerades med hjälp av insatser avsedda för 24 brunnar och 6 såväl vävnadsodlingsplattor. Dessa insättningsstorlekar är relativt lätta att hantera med steril pincett, och enkel manipulering är kritisk i preventing oönskad överföring av bakterier från det övre utrymmet till det undre utrymmet av brunnen. För experiment som involverar insamling av värdcellysat, 6 brunnar ger en lämplig cellantalet per förutsättning för de flesta analyser och är stor nog att rymma cellskrapor för provtagning. För cytotoxicitetsanalyser i vilket värdcellerna förblir vidhäftande och är märkta med en fluorescerande eller kolorimetrisk färgämne som kan mätas på en plattläsare (t.ex. etidium homodimer-analysen, exklusion med trypanblått), är användningen av en 24-brunnsplatta med motsvarande skär rekommenderad. För experiment där cellodlingsmediet kommer att samlas in och analyseras (t.ex. LDH-frisättning, cytokin studier) antingen 24 bra eller 6-brunnsplattor kan användas, även om de mindre brunnarna ger vanligtvis tillräcklig provvolymer för dessa analyser och minimera användningen av den nödvändiga reagens. Totalt sett är mycket mångsidig den metod och kan anpassas efter behov för att förbereda samples för många uppföljnings applikationer.
The authors have nothing to disclose.
We thank our fellow Lee Lab colleagues, who provided valuable insight and expertise that greatly assisted this research. This work was supported by the Young Innovator Award from the National Institute of Health, awarded to S.W. Lee (NIH-1DP2OD008468-01). R.A. Flaherty is supported by the Albertus Magnus Fellowship provided by Dr. Robert C. Boguslaski, and a teaching assistantship through the Eck Institute for Global Health at the University of Notre Dame.
Todd-Hewitt broth | Acumedia | 7161A | Use appropriate broth for bacterial species of interest. |
BioSpectrometer | Eppendorf | basic model | Any UV-Vis spectrophotometer is suitable. |
Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Other brands are suitable. |
Agar | Sigma | A1296-1kg | Other brands are suitable. |
HaCaT human epithelial keratinocytes | Gift from lab of Victor Nizet. | ||
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | Use appropriate media for cell line of interest. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S162H | Use appropriate media additives for cell line of interest. |
10cm tissue culture dishes | Nunc | 150350 | Other brands are suitable. |
6 well tissue culture dishes | CytoOne | cc7682-7506 | Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert. |
24 well tissue culture dishes | CytoOne | cc7682-7524 | Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert. |
Glass coverslips | Fisherbrand | 12-541-B | These must be autoclaved prior to use for cell plating. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
Phenol Red Free DMEM | Life Technologies | 31053028 | Phenol Red Free media is only required for the LDH release assay. |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
L-glutamine | Gibco | 25030149 | Only required to supplement cell culture media for LDH release assay. |
Sodium pyruvate | Gibco | BP356100 | Only required to supplement cell culture media for LDH release assay. |
Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (6 well) | Corning | 3540 | |
Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (24 well) | Corning | 3595 | |
Forceps | Fisher | 3120018 | These must be sterilized with ethanol prior to handeling Transwell inserts. |
Cell scrapers | Fisherbrand | 08-100-241 | These are only required for the collection of cell lysates. |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | TOXIC. This is only required for immunofluorescence imaging. |
Bicinchoninic acid (BCA) assay kit | Pierce | 23227 | Other protein quantification assays may be used. |
Tris-glycine 4-15% polyacrylamide gels | BioRad | 4561083 | Buffer system and percent polyacrylamide should be selected based on proteins of interest. |
Electrophoresis cassette supplies | BioRad | 1658063 | Only required for Western Blotting. |
Electrophoresis power supply | BioRad | 1645050 | Only required for Western Blotting. |
Western blot transfer cassette | BioRad | Only required for Western Blotting. | |
Polyvinylidene (PVDF) Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | Only required for Western Blotting. |
Tween 20 | Sigma | P1379-500mL | |
Rabbit IgG-HRP secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc2030 | The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. |
Mouse IgG-HRP secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc2031 | The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. |
Phospho-p38 (T180+T182) MAPK antibody | Cell Signaling | 4511 | Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest. |
Total p38 MAPK antibody | Cell Signaling | 8690 | Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest. |
Goat anti-rabbit IgG Alexafluor488 | Molecular Probes | A-11034 | Other secondary antibodies may be used for immunofluoresence imaging detection. |
LumiGLO Detection Reagent | KPL | 54-61-00 | Only required for Western Blotting with detection on film. |
Detection film | Biodot | BDB57 | Only required for Western Blotting with detection on film. |
DeltaVision Nikon 90i fluoresence microscope | Nikon | Other fluorescence microscopes are suitable for these analyses. | |
Normal goat serum | Thermo Scientific | 31873 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284-500mL | |
DAPI nuclear stain | Cell Signaling | 4083 | Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest. |
Rhodamine-phalloidin actin stain | Molecular Probes | R415 | Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest. |
Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Only required for immunofluorescence imaging. |
Ethidium homodimer 1 | Molecular Probes | E1169 | Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay. |
Spectramax M5 Microplate Reader | Molecular Devices | Other microplate readers capable of detecting UV-vis, fluorescence and luminescence may be suitable. | |
Saponin | Sigma | 47036-50G-F | Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay. |
Molecular Probes ATP Determination Kit | Life Technologies | A22066 | Other kits are likely to be suitable. |
Cytotoxicity Detection Kit for LDH release | Roche | 11644793001 | Other kits are likely to be suitable. |
Nonidet P40 Substitute | Sigma | 74385-1L | Other suppliers are suitable. |
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420B | Other cocktails are likely to be suitable. |
SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA-free | Sigma | S8830-2TAB | Other cocktails are likely to be suitable. |