Den Terroir Concept Tolkad genom Grape Berry Metabolomics och transkriptomik
Summary
Den här artikeln beskriver tillämpningen av oriktade metabolomik, transkriptomik och multivariat statistisk analys till druv bär transkript och metaboliter i syfte att få insikt i terroir konceptet, det vill säga påverkan av miljön på bär kvalitetsegenskaper.
Abstract
Terroir avser en kombination av miljöfaktorer som påverkar egenskaperna hos grödor såsom vinranka (Vitis vinifera) enligt vissa livsmiljöer och förvaltningspraxis. Den här artikeln visar hur vissa terroir signaturer kan detekteras i bär Metabolome och transkriptom av grapevine sorten Corvina använder multivariat statistisk analys. Metoden kräver först en lämplig stickprovsplan. I denna fallstudie var en särskild klon av Corvina sort vald för att minimera genetiska skillnader, och prover samlades in från sju vingårdar som representerar tre olika makro zoner under tre olika växtsäsonger. En oriktade LC-MS metabolomik tillvägagångssätt rekommenderas på grund av dess höga känslighet, tillsammans med en effektiv databehandling med hjälp av MZmine programvara och en metabolit identifiering strategi baserad på fragmentering rädsanalys. Omfattande transkriptom analys kan åstadkommas med användning av mikromatriserinnehållande prober som täcker ~ 99% av alla förutsagda vinranka gener, vilket möjliggör samtidig analys av alla differentiellt uttryckta gener i samband med olika terroirs. Slutligen kan multivariat dataanalys baserad på projektionsmetoder användas för att övervinna den starka årgång-specifik effekt, vilket gör att metabolomik och transkriptomik data som skall integreras och analyseras i detalj för att identifiera informativa korrelationer.
Introduction
Storskalig dataanalys baserad på genomen, proteom och metabolom av växter ger oöverträffad inblick i beteendet hos komplexa system, såsom terroir egenskaperna hos vin som speglar samspelet mellan grapevine växter och deras miljö. Eftersom terroir av ett vin kan vara åtskilda även då identiska vinranka kloner odlas i olika vingårdar, är genomik analys av liten nytta eftersom klonala genomen är identiska. I stället är det nödvändigt att titta på korrelationer mellan genuttryck och metaboliska egenskaper bären, som bestämmer kvalitets drag av vin. Analysen av genexpression vid nivån för de transkriptom nytta av de likartade kemiska egenskaperna hos alla transkript, vilket underlättar kvantitativ analys genom att utnyttja universella egenskaper såsom hybridisering till immobiliserade prober på mikroarrayer. I motsats, universella analysmetoder proteomik ennd metabolomik är mer utmanande på grund av den enorma fysiska och kemiska olikhet enskilda proteiner och metaboliter. I fallet med metabolomik denna mångfald är ännu mer extrem eftersom enskilda metaboliter skiljer sig kraftigt i storlek, polaritet, överflöd och flyktighet, så ingen enskild utvinningsprocessen eller analysmetod erbjuder ett helhetsgrepp.
Bland de analytiska plattformar som lämpar sig för icke-flyktiga metaboliter, de som baseras på högupplösande vätskekromatografi kopplat till masspektrometri (HPLC-MS) är mycket känsligare än alternativ såsom HPLC med ultraviolett eller diodarraydetektorer (HPLC-UV, HPLC-DAD ) eller kärnmagnetisk resonans (NMR) -spektroskopi, men kvantitativ analys genom HPLC-MS kan påverkas av sådana fenomen som matriseffekt och jon undertryckande / förbättringen 1-3. Undersökningen av sådana effekter vid analys av Corvina vindruvor med HPLC-MS med hjälp av en elektro jonisering källa (HPLC-ESI-MS), visade att socker och andra molekyler med de lägsta retentionstiderna var starkt underreported, förmodligen också avspeglar det stora antalet molekyler i denna zon, och att det överflöd av andra molekyler kan underskattas, överskattade eller opåverkad av matriseffekt , men data normalisering för matriseffekt tycktes ha begränsad inverkan på den totala resultat 4,5. Den metod som beskrivs häri är optimerad för analys av medel polaritet metaboliter som ackumuleras vid höga nivåer i vindruvor under mognaden, och som avsevärt påverkas av jordmånen. De omfattar antocyaniner, flavonoler, flavan-3-oler, procyanidins, andra flavonoider, resveratrol, stilbener, hydroxikanelsyra syror och hydroxibensoesyrans syror, vilka tillsammans bestämmer färg, smak och hälsorelaterade egenskaper viner. Andra metaboliter, såsom sockerarter och alifatiska organiska syror, ignoreras eftersom kvantifiering genom HPLC-MS är otillförlitliga på grund av att matrisen effekt och jon undertryckande fenomen 5. Inom polariteten intervall som valts av denna metod är den metod oriktade i att det syftar till att upptäcka så många olika metaboliter som möjligt 6.
Transkriptomik metoder som gör tusentals vinranka transkript som skall övervakas samtidigt underlättas genom tillgängligheten av det kompletta vinranka genomsekvensen 7,8. Tidiga transkriptomik metoder baserade på hög genomströmning cDNA sekvense har utvecklats med tillkomsten av nästa generations sekvensering i en samling förfaranden kollektivt beskrivs som RNA-Seq teknik. Detta tillvägagångssätt har snabbt blivit den föredragna metoden för transkriptomik studier. Men en stor mängd litteratur baserad på microarray, som tillåter tusentals transkript som ska kvantifieras parallellt genom hybridisering, har samlat för vinrankor. I själva verket, innan RNA-Seq blev en mainstream-teknologi, hade många engagerade kommersiella microarray plattformar varitutvecklade tillåter vinranka transkriptom som skall inspekteras i detalj. Bland det stora utbudet av plattformar, endast två tillåtna genomet hela transkriptom analys 9. Den mest utvecklade array tillät hybridisering av upp till 12 oberoende prover på en enda enhet, vilket minskar kostnaderna för varje experiment. De 12 under arrayer var och en består 135.000 60-mer sonder representerande 29,549 Grapevine transkript. Denna enhet har använts i ett stort antal studier 10-24. Dessa två plattformar har nu upphört, men en ny anpassad microarray har nyligen utformats och representerar en senare utveckling eftersom det innehåller ett ännu större antal prober som representerar ytterligare nyupptäckta grapevine gener 25.
De stora försäljningsdatamängder som produceras av transkriptomik och metabolomik analys kräver lämpliga statistiska metoder för analys av data, inklusive multivariata metoder för att fastställa sambanden mellan annan forms från data. De mest använda multivariata metoder är de som är baserade på projektion, och dessa kan vara utan tillsyn, såsom principalkomponentanalys (PCA), eller övervakas, såsom dubbelriktad ortogonal projektion till latenta strukturer diskriminantanalys (O2PLS-DA) 26. Protokollet presenteras i denna artikel använder PCA för undersökande dataanalys och O2PLS-DA för att identifiera skillnader mellan grupper av prover.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den här artikeln beskriver de metabolomik, transkriptomik och protokoll statistisk analys som används för att tolka druv bär terroir konceptet. Metabolomics analys genom HPLC-ESI-MS är tillräckligt känslig för att detektera ett stort antal metaboliter samtidigt, men relativ kvantifiering påverkas av matriseffekt och jon undertryckande / förbättringen. Emellertid har ett liknande tillvägagångssätt som redan använts för att beskriva mognad och efter skörd förtvining av Corvina bär, och korrigering av ma…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work benefited from the networking activities coordinated within the EU-funded COST ACTION FA1106 “An integrated systems approach to determine the developmental mechanisms controlling fleshy fruit quality in tomato and grapevine”. This work was supported by the ‘Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale’ project funded by the CARIVERONA Bank Foundation and by the ‘Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)’ project funded by the Italian Ministry of Agricultural and Forestry Policies. SDS was financed by the Italian Ministry of University and Research FIRB RBFR13GHC5 project “The Epigenomic Plasticity of Grapevine in Genotype per Environment Interactions”.
Materials
| Mill Grinder | IKA | IKA A11 basic | |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 127 Solvent Module HPLC |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5×2.1mm; 5μm) Guard Column |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150×2.1mm; 3μm) Column |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap. |
| Extraction solvents and HPLC buffers | Sigma | 34966 | Methanol LC-MS grade |
| Sigma | 94318 | Formic acid LC-MS grade | |
| Sigma | 34967 | Acetonitrile LC-MS grade | |
| Sigma | 39253 | Water LC-MS grade | |
| Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) | Sartorius | 17764 | |
| Softwares for data collection (a) and processing (b) | Bruker Daltonics | – | Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b) |
| Spectrum Plant Total RNA kit | Sigma-Aldrich | STRN250-1KT | For total RNA extractino from grape pericarps |
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | 1000 | |
| BioAnalyzer 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| RNA 6000 Nano Reagents | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| RNA Chips | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 | Agilent Technologies | 5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 | Agilent Technologies | 5188-5326 | |
| LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color | Agilent Technologies | 5190-2305 | |
| Kit RNA Spike In – One-Color | Agilent Technologies | 5188-5282 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | For cRNA Purification |
| Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray | Agilent Technologies | G2514F-048771 | |
| eArray | Agilent Technologies | – | https://earray.chem.agilent.com/earray/ |
| Gasket slides | Agilent Technologies | G2534-60012 | Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization |
| Thermostatic bath | Julabo | – | |
| Hybridization Chamber | Agilent Technologies | G2534-60001 | |
| Microarray Hybridization Oven | Agilent Technologies | G2545A | |
| Hybridization Oven Rotator Rack | Agilent Technologies | G2530-60029 | |
| Rotator Rack Conversion Rod | Agilent Technologies | G2530-60030 | |
| Staining kit | Bio-Optica | 10-2000 | Slide-staining dish and Slide rack |
| Magnetic stirrer device | AREX Heating Magnetic Stirrer | F20540163 | |
| Thermostatic Oven | Thermo Scientific | Heraeus – 6030 | |
| Agilent Microarray Scanner | Agilent Technologies | G2565CA | |
| Scanner Carousel, 48-position | Agilent Technologies | G2505-60502 | |
| Slide Holders | Agilent Technologies | G2505-60525 | |
| Feature extraction software v11.5 | Agilent Technologies | – | inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA |
| SIMCA + V13 Software | Umetrics |
Referências
- Jessome, L. L., Volmer, D. A. Ion suppression: A major concern in mass spectrometry. Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).
- Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go?. Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).
- Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. A. Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era. Phytochem. 62 (6), 817-836 (2003).
- Bottcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Willscher, E., Scheel, D., Clemens, S. Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Anal Chem. 79 (4), 1507-1513 (2007).
- Toffali, K., et al. Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis. Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).
- Martin, J. C., et al. Can we trust untargeted metabolomics? Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study. Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).
- Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).
- Velasco, R., et al. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. Plos One. 2 (12), (2007).
- Tornielli, G. B., Zamboni, A., Zenoni, S., Delledonne, M., Pezzotti, M., Gerós, H., Chaves, M., Delrot, S. Ch. 11. The Biochemestry of the Grape Berry. 11, (2012).
- Anesi, A., et al. Towards a scientific interpretation of the terroir concept: plasticity of the grape berry metabolome. BMC Plant Biol. 15, 1-17 (2015).
- Berdeja, M., et al. Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming. Hort Res. 2, 1-13 (2015).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses. BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method. Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits. BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).
- Cavallini, E., et al. Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant. Plant & Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).
- Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).
- Dal Santo, S., et al. The plasticity of the grapevine berry transcriptome. Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).
- Fasoli, M., et al. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).
- Gambino, G., et al. Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis. J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).
- Ghan, R., et al. Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).
- Pastore, C., et al. Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine. BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).
- Pastore, C., et al. Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening. BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).
- Rinaldo, A. R., et al. A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins. Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).
- Royo, C., et al. Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco. J Exp Bot. , 259-273 (2015).
- Venturini, L., et al. De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity. BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).
- Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products. Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).
