साइटोसिन का संशोधित रूप संवेदनशील immunohistochemistry का उपयोग की जांच
Summary
Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.
Abstract
Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.
Introduction
डीएनए (5mC) में साइटोसिन अड्डों में से मेथिलिकरण रीढ़ ट्रांसक्रिप्शनल मुंह बंद 1 के साथ जुड़े जीनोम में पाया एक प्रमुख epigenetic मार्क का प्रतिनिधित्व करता है। 5mC पेश किया जा रहा है और डीएनए Methyltransferases 2-5 से बनाए रखा है, और जीनोमिक चिन्ह, एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता, सेलुलर भेदभाव, और विकास के 3, 6। नतीजतन, के विघटन सहित जैविक प्रक्रियाओं की संख्या में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है 5mC जीनोमिक पैटर्न रोगों 7, 8-11 की संख्या के साथ जुड़ा हुआ है। विकास और रोग में 5mC भूमिका को समझने में प्रगति के बावजूद, यह अभी भी काफी हद तक अनजान बने हुए है कि कैसे इस मार्क के विकास और वयस्क ऊतकों में हटाया जा रहा है। डीएनए demethylation के कई संभावित तंत्र हाल ही में 5mC अनुक्रमिक ऑक्सीकरण के उत्पादों को दस-ग्यारह translocation Enzym द्वारा मध्यस्थता की सक्रिय और निष्क्रिय demethylation तंत्र 12, 13, 14, 15 सहित प्रस्तावित किया गया है। डिस्कवरीes (tet1 / 2/3) ऐसे 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), और में यूकेरियोटिक डीएनए 16, 17, 18, 19 के लिए प्रेरित अटकलों 5-carboxylcytosine (5caC) क्या वे के मध्यवर्ती के रूप में सेवा कर सकते हैं के रूप में डीएनए demethylation प्रक्रियाओं या अपने आप 13 में स्थिर रूप में कार्य epigenetic निशान। प्रदर्शन है कि आधार छांटना मरम्मत के घटक, थाइमिन डीएनए glycosylase (TDG) बाँध और डीएनए 19 से दोनों 5fC और 5caC दूर कर सकते हैं, 20 एक सक्रिय डीएनए demethylation में संशोधित 5mC डेरिवेटिव के लिए एक भूमिका पता चलता है। हाल दिखा 5fC / 5caC ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन 29 में इन अंकों की संभावित संलिप्तता के लिए आरएनए द्वितीय Processivity अंक की दर मिलाना कर सकते हैं कि सबूत। 5mC का ऑक्सीकरण रूपों की इस संभावित जैविक महत्व के कारण, जैव रासायनिक और एंटीबॉडी आधारित तकनीकों की एक श्रृंखला उनके जीनोमिक वितरण और वैश्विक सामग्री 16, 19-24 के अध्ययन के लिए नियोजित किया गया है।
यह देखते हुए टी के सबसे किवह कशेरुकी अंगों विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं से मिलकर बनता है और संशोधित साइटोसिन अड्डों में से वितरण ऊतक और सेल प्रकार विशिष्ट है कि 16-18, 20, 23, 25-27, विभिन्न ऊतकों में ऑक्सीकरण 5mC डेरिवेटिव के स्थानिक वितरण का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक हो जाता है उनके जैविक कार्यों अनावरण के लिए आवश्यक कार्य है। जैव रासायनिक और एंटीबॉडी आधारित दृष्टिकोण से अधिकांश विभिन्न ऊतकों और सेल-प्रकार में 5mC के संशोधित रूपों के वितरण के बारे में किसी भी स्थानिक जानकारी प्रदान नहीं करते। इसके विपरीत, immunochemistry आधारित तकनीक स्थानिक वितरण और 5mC 28 और उसके ऑक्सीकरण डेरिवेटिव 20 के परमाणु स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए एक तेजी से उपकरण प्रदान कर सकते हैं। यही कारण है कि कहा जाता है, माउस जीनोम 18 में 5fC की सूचना बहुत कम बहुतायत (20 हर 10 6 साइटोसिन में) और 5caC (3 हर 10 6 साइटोसिन में) मानक immunochemistry के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है।
यहाँ,हम एक बेहद संवेदनशील immunochemical तरीका है कि मजबूत प्रदान करता है और स्तनधारी मस्तिष्क के ऊतकों में साइटोसिन का ऑक्सीकरण फार्म का एक तेजी से पता लगाने का वर्णन है। peroxidase संयुग्मित माध्यमिक एक संकेत प्रवर्धन कदम के साथ मिलकर एंटीबॉडी को शामिल करके, इस विधि 5fC और 5caC की बहुत कम मात्रा का पता लगाने की चुनौतियों में गतिरोध उत्पन्न। इसके अलावा, इस तकनीक को प्रभावी ढंग से इन epigenetic निशान की जैविक कार्यों elucidating में दूसरे दृष्टिकोण के पूरक वंश विशिष्ट मार्कर के साथ साइटोसिन के सह पता लगाने के संशोधित रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हालांकि 5mC ऑक्सीकरण डेरिवेटिव, 5fC और 5caC कुछ ऊतकों में की सूचना कम बहुतायत एक मानक immunochemistry प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण सीमाओं को प्रस्तुत करेंगे, peroxidase संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के समावेश तय ऊतकों और कोशिकाओं में इन साइटोसिन संशोधनों का पता लगाने के लिए अनुमति (चित्रा 2) । हालांकि, tyramide समाधान के साथ इष्टतम ऊष्मायन समय tyramide संकेत प्रवर्धन किट जहां संकेत तीव्रता और tyramide आधारित संकेत प्रवर्धन की अवधि के बीच एक रैखिक संबंध मनाया जाता है जानकारी के लिए, के प्रत्येक व्यक्ति बैच के लिए प्रयोगात्मक अनुकूलित किया जाना चाहिए अल्मीडा एट अल को देखें। 2012 26 । इसके अलावा, संकेत / पृष्ठभूमि अनुपात काफी अतिरिक्त एंटीबॉडी के कुशल हटाने की अनुमति के लिए एक Coplin जार में washes ले जाने से बढ़ाया जा सकता है। tyramide समाधान के साथ ऊष्मायन के बाद, यह महत्वपूर्ण है तुरंत घ पीबीटी समाधान में धोने से प्रतिक्रिया को रोकने केecrease पृष्ठभूमि धुंधला। यह वर्गों प्रक्रिया के दौरान किसी भी बिंदु पर सुखाने के लिए अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है।
डीएनए depurination की दक्षता में 37 डिग्री सेल्सियस पर depurination प्रतिक्रिया से बाहर ले जाने से सुधार किया जा सकता है। 4 एन एचसीएल के बजाय 2 का उपयोग करते समय एन के रूप में यह डबल असहाय डीएनए के साथ विशेष रूप से सूचना का आदान प्रदान, डीएनए depurination के लिए 4 एन एचसीएल का उपयोग कर DAPI के साथ सह-धुंधला अनुमति नहीं होगी 5mC के संशोधित रूपों का धुंधला बढ़ाता है।
हालांकि इस तकनीक साइटोसिन ठिकानों जहां पहचाने जाने का संशोधित रूप से मजबूत अर्द्ध मात्रात्मक आकलन प्रदान कर सकते हैं, यह 5mC या उसके ऑक्सीकरण डेरिवेटिव के पूर्ण स्तर के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। इसलिए, हम अन्य पूरक के उपयोग की सलाह देते हैं लेकिन मात्रात्मक 16, 19 -24 दृष्टिकोण। स्तनधारी जीनोम में 5mC ऑक्सीकरण डेरिवेटिव की खोज के बाद से, कई दृष्टिकोण उनके जैविक भूमिकाओं 16, 19-24 अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। इन approa यद्यपिटांके 5mC ऑक्सीकरण डेरिवेटिव के पूर्ण स्तर का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण हो सकता है, वे अपने स्थानिक वितरण 20, 26 के विषय में जानकारी प्रदान नहीं करते। हम सफलतापूर्वक विधि यहाँ वर्णित का इस्तेमाल किया है विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में स्थानिक वितरण और 5mC ऑक्सीकरण डेरिवेटिव के स्थानीयकरण नक्शा करने के लिए विकासशील और वयस्क मस्तिष्क 20 की
उनके स्थानिक वितरण 20 खुलासा करके, इस तकनीक का जैविक प्रभाव और विभिन्न जैविक संदर्भों में 5mC का ऑक्सीकरण डेरिवेटिव जहां 5mC के इन संशोधित डेरिवेटिव सेलुलर भेदभाव, विकास और रोग सहित पाया जा सकता है के भाग्य को समझने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। इसके अलावा, विधि हम यहाँ वर्णन tyrami के साथ अलग अलग ऊष्मायन समय पर peroxidase प्रतिक्रिया के कैनेटीक्स (जो धुंधला तीव्रता के लिए आनुपातिक है) का आकलन करने से विभिन्न ऊतकों में 5mC का ऑक्सीकरण डेरिवेटिव के अर्द्ध मात्रात्मक आकलन दे सकते हैंडी 26।
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Advanced Microscopy Unit (School of Life Sciences, University of Nottingham) and the Histology team of MRC Human Reproductive Sciences Unit (Edinburgh), the Institute of Neuroscience at the ULB and the FNRS for help and support. This work was supported by MRC (MR/L001047/1 to A.D.J.).
Materials
| Coplin jar | Cole-Parmer | UY-48585-30 | Glass made |
| Xylene | Use only in Class II safety cabinet | ||
| Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific | 12821680 | pPH 7.5, filtered before use |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Once made can be stored at -20°C in aliquotes for several months |
| 4% formaldehyde (FA) | Sigma Aldrich | F8775 | Once made can be stored at -20°C in aliquotes for several months |
| Ethanol, anhydrous denatured, histological grade | Sigma Aldrich | 64-17-5 | 95, 75, 50 % in PBS |
| 0.01 % Tween 20 in PBS | Sigma Aldrich | P9416 | PBT |
| 0.5% Triton X-100 in PBS | Sigma Aldrich | X100 | PBX |
| 2 N HCl | Sigma Aldrich | 71826 | caution extremely toxic |
| 100 mM Tris-HCl | Promega | H5121 | PH adjusted to 8.5 |
| hydrophobic barrier pen | Abcam | ab2601 | for immunohistochemistry |
| Slide moisture chamber | Scientific Device Laboratory | 197-BL | |
| anti-5mC mouse antibody | Diagenode | C15200081 | monoclonal primary antibody |
| Anti-5hmC antibody | Active Motif | 39791 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Anti-5caC antibody | Active Motif | 61225 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody | Dako | K1497 | |
| 555-congjuated goat anti-mouse antibody | Molecular probes | A-11005 | secondary antibody |
| 10% BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Blocking solution |
| 22x32mm Glass cover slips | BDH | 406/0188/24 | |
| Tyramide Signal Amplification System | Perkin Elmer | NEL741001KT | Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Colourless nail polish | |||
| chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody | Thermo Scientific | PA5-18598 | 1:400 dilution |
| anti-NeuN mouse monoclonal antibody | Merck milipore | MAB377B | 1:400 dilution |
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