El trabajo con células auditivas HEI-OC1
Summary
House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.
Abstract
HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 °C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 °C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.
Introduction
House Ear Institute-órgano de Corti 1 células (IES-OC1) se derivan del órgano de la audición de un 1,2 ratón transgénico. La incubación de cualquier célula de este ratón transgénico a 33 ° C / 10% de CO 2 (condiciones permisivas) induce la expresión de un gen de inmortalización que desencadena de-diferenciación y la proliferación acelerada; mover las células a 39 ° C / 5% de CO 2 (condiciones no permisivas) conducen a disminución de la proliferación, la diferenciación y, por lo menos en el caso de HEI-OC1, la muerte celular 2,3.
células HEI-OC1 fueron clonados y caracterizados en nuestro laboratorio hace más de una década, y los estudios iniciales indicaron que expresan marcadores específicos de células ciliadas cocleares, como prestin, miosina 7a, Atoh1, BDNF, calbindina y calmodulina, sino también los marcadores de apoyo células como la conexina 26 y el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-R) 2. Por lo tanto, se sugirió que HEI-OC1 podría representar un common progenitoras de las células sensoriales y de soporte del órgano de Corti 2. Estudios paralelos proporcionan una fuerte evidencia de que arquetípica fármacos ototóxicos, tales como cisplatino, gentamicina y estreptomicina inducida por la activación de la caspasa-3 en estas células, mientras que los medicamentos que se consideran no ototóxicos, como la penicilina, no lo hicieron 2,3. Por lo tanto, esta línea celular fue propuesto como un sistema in vitro para investigar los mecanismos celulares y moleculares implicados en la ototoxicidad y para la detección de la ototoxicidad potencial o propiedades otoprotective de nuevos medicamentos farmacológicos. Se estima que las células HEI-OC1 se han utilizado en más de ciento cincuenta estudios publicados en los últimos diez años.
Mientras que mirando el potencial pro-apoptóticos efecto de diferentes drogas fue el principal objetivo de la mayoría de los estudios con esta línea celular, otros procesos celulares importantes como la autofagia y la senescencia simplemente han comenzado a ser investigado en células HEI-OC1 4-7. yona reciente estudio realizado en nuestro laboratorio 8, que utiliza células HEI-OC1 para recoger un conjunto completo de datos sobre la muerte celular, la supervivencia, proliferación, senescencia y la autofagia inducida por diferentes drogas farmacológicas utilizadas con frecuencia en la clínica. También comparamos algunas de las respuestas de las células HEI-OC1 con las de células HEK-293 (células de riñón embrionario humano) y HeLa (células epiteliales humanas) que recibe un tratamiento idéntico. Nuestros resultados indican que las células HEI-OC1 responden a la cada fármaco de una forma característica, con una dosis-distintivo y la sensibilidad dependiente del tiempo de al menos uno de los mecanismos en estudio. También hicimos hincapié en que el estudio que una correcta interpretación de los resultados experimentales requerirá la realización de estudios paralelos con más de una técnica 8.
En un estudio diferente se investigó el uso de células HEI-OC1 para evaluar la respuesta funcional de prestin, la proteína de motor de las células ciliadas externas cocleares (CCE) 9 </sarriba>. Hemos informado citometría de flujo y estudios de microscopía láser confocal de barrido en el patrón de expresión prestina, así como la capacitancia no lineal (NLC) y los estudios de fijación de células enteras parche en células cultivadas HEI-OC1 al permisiva (P-IES-OC1) y no permisivas (NP-IES-OC1) condiciones. Nuestros resultados indican que tanto la expresión prestina y membrana plasmática aumento total de la localización de una manera dependiente del tiempo en las células NP-IES-OC1. Curiosamente, también se encontró que el aumento en la localización prestin en la membrana plasmática de las células NP-HEI-OC1 correlacionados con una disminución de Na + K + ATPasa, que transloca desde la membrana plasmática al citoplasma sin cambios significativos en la expresión de células total. Además, hemos demostrado que las células P-HEI-OC1 tienen un robusto NLC asociado a prestina la función motora, que disminuye cuando la densidad de las moléculas de prestina presentes en la membrana plasmática se incrementó. En conjunto, estos resultados apoyan firmemente la utilidad de HEI-OC1 en las células para investigar las proteínas auditivas.
En este artículo de vídeo se describe cómo la cultura células HEI-OC1, por lo que es conveniente utilizar células que crecen en condiciones permisivas (P-IES-OC1) para los estudios de citotoxicidad, la forma de evaluar el mecanismo / s de la citotoxicidad inducida por fármacos y cómo para llevar a cabo estudios electrofisiológicos (por ejemplo, patch-clamp, la capacitancia no lineal (NLC)) para investigar las propiedades funcionales de prestin, el motor molecular de OHCs cocleares.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este informe se describe cómo la cultura células HEI-OC1 y las utilizamos para evaluar los mecanismos de citotoxicidad inducida por fármacos y para investigar las propiedades funcionales de prestina, el motor molecular de las CCE coclear. Los procedimientos técnicos, sin embargo, son lo suficientemente generales como para ser adaptado fácilmente a diferentes estudios.
Todos los protocolos descritos aquí requieren el uso correcto de técnicas de cultivo celular bien establecidos <sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.
Materials
| HEI-OC1 cells | ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS | ||
| Class II Biological Safety cabinet | The Baker Company | Sterilgard III | AND COMPANIES INDICATED IN THE |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert 25 | EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR |
| Waterbath | Stovall | HWB115 | PRODUCT COULD BE USED. |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
| Two (2) Cell incubators, one at 33°C/10% CO2 and other at 39°C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
| Cell culture dishes, PS, 100 x 20 mm with vents | Greinier Bio-One | 664-160 | |
| Cell culture dishes , PS, 60 x 15 mm with vents | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Cellstar tissue culture flasks 250 mL | Greiner Bio-One | 658-175 | |
| Cellstar tissue cultur flasks 550 mL | Greiner Bio-One | 660-175 | |
| 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Microtest Tissue culture plate, 96 well,flat bottom with lid | Becton Dickinson | 353072 | |
| Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white,clear botton | Greiner Bio-One | 655098 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
| 15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Life Technologies | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
| Trypsin, 0.25% | Life Technologies | 25200-056 | |
| TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4890-25-K | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8091 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling | 6813 | |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | C5789 | |
| Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G8741 | |
| FACSAriaIII instrument | BD Biosciences | FACSAriaIII | With 488 nm excitation (blue laser) |
| Digital Blot Scanner | LI-COR | C-DiGit | |
| Electrophoresis and Blotting Unit | Hoefer | SE300 miniVE | |
| Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software | Molecular Devices | SpectraMax 5 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Puller for preparing patch electrodes | Sutter Instruments | P-97 |
Referências
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
- Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
- Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
- Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
- Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
- Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
- Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
- Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
- Celis, J. E. . Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (2006).
- Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
- Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
- Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
- Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
- Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
- Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
- Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
- Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
- Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
- Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
- Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin’s Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
- Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
- Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
- Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).
