En Mimic av svulstens mikromiljø: En enkel metode for å generere beriket celle populasjoner og Gransker inter Communication

Summary

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

Abstract

Forstå de tidlige heterotypic samspillet mellom kreftceller og omkringliggende ikke-kreft stroma er viktig å belyse hendelsene som førte til stromal aktivering og etablering av svulsten mikromiljøet (TME). Flere in vitro og in vivo modeller av TME har blitt utviklet; imidlertid, generelt disse modellene ikke lett tillater isolering av individuelle cellepopulasjoner, under ikke-perturbere betingelser, for videre studier. For å omgå denne vanskelighet, har vi anvendt en in vitro TME-modell ved hjelp av et cellevekst substrat bestående av en permeabel mikroporøs membran innsats som tillater enkel produksjon av høyanriket celle populasjoner dyrket nært, men hver for seg, på hver side av innlegget membran for utvidet co -Kultur ganger. Gjennom bruk av denne modellen, er vi i stand til å generere sterkt anriket kreft-assosiert fibroblast (CAF) populasjoner fra normale diploide humane fibroblaster følgendeko-kultur (120 timer) med høyt metastatisk humane bryst karsinomceller, uten bruk av fluorescerende merking og / eller cellesortering. I tillegg, ved å modulere pore-størrelse på innsatsen, kan vi kontrollere for modusen av intercellulær kommunikasjon (f.eks gap junction kommunikasjon, utskilles faktorer) mellom de to heterotypic cellepopulasjoner, som tillater undersøkelse av de mekanismer som ligger til grunn for utviklingen av TME, inkludert rollen til gap junction-permeabilitet. Denne modellen tjener som et verdifullt verktøy i å øke vår forståelse av de innledende hendelser som fører til kreft-stroma initiering, den tidlige utviklingen av TME, og den modulerende effekt av stroma på svarene av kreftceller til terapeutiske midler.

Introduction

Svulsten mikromiljøet (TME) er et svært komplekst system består av carcinoma celler som co-eksistere og utvikle seg sammen med verts stroma. Dette stromal komponenten består vanligvis av fibroblaster, myofibroblasts, endotelceller, forskjellige immunkomponenter, samt en ekstracellulær matriks ^1. En vesentlig bestanddel, ofte størstedelen av denne stroma blir aktiverte fibroblaster, ofte referert til som kreftassosiert fibroblaster eller karsinom-assosiert fibroblaster (CAF) ^2,3. I motsetning til vanlige, ikke-aktiverte fibroblaster, kafeer bidra til tumor initiering, progresjon, angiogenese, invasjon, metastase, og gjentakelse ^4-11 i et bredt utvalg av karsinomer, inkludert bryst, prostata, lunge, bukspyttkjertel, hud, tarm, øsofagus, og eggstokk ^5,6,12-17. Likevel forblir det nøyaktige innholdet i bidraget fra kafeer gjennom kreft patogenesen dårlig definert. Videre har kliniske bevis vist en prognostisk verdi av kafeer, Samkjøre deres tilstedeværelse til høyverdig malignitet, terapi svikt, og generelt dårlig prognose ^10,18,19.

Åpenbart øke vår forståelse av hendelsene som starter i CAF utvikling, samt inter kommunikasjon medierer sin rolle innenfor TME, kan gi spennende nye terapeutiske mål og forbedrede strategier som kan forbedre pasientens utfall. Mot dette målet, har flere in vivo og in vitro-modeller er utviklet. Mens in vivo tilnærminger er mer reflektert av pasientenes TME, besitter de begrensninger, inkludert den enorme kompleksitet og heterogenitet både innenfor og mellom svulster. Videre tumorprøver fra mennesker ofte representerer høyt utviklet TME og tillater ikke en forståelse av TME initierende hendelser. Eksperimentelle dyrestudier har noen fordeler, men generalisering av data fra dyreforsøk til mennesker bør gjøres med forsiktighet på grunn av forskjeller i physiology mellom mennesker og dyr så som gnagere (f.eks, til tiol kjemi ^20, metabolske rate ^21, toleranse reke ^22, etc.). Videre, i motsetning til den menneskelige befolkning, som er genetisk heterogen natur, forsøksdyr blir typisk avlet til homogenitet. Dessuten er det ofte vanskelig å undersøke fysiologiske transiente variasjoner og celle-fenotype forandringer, så vel som for å kontrollere for spesifikke eksperimentelle parametere ved bruk av dyr som gnagere. Således in vitro 2- og 3-dimensjonale (2D og 3D) vevkultursystemer modeller er ofte benyttet for å fremme den grunnleggende forståelse av TME utvikling. Til tross for deres mangel på en presis skildring av kompleksiteten i in vivo-systemer, disse modellene har fordeler som i stor grad forenkle mekanistiske undersøkelser. In vitro-modeller gir mulighet for en mer forenklet, fokusert og kostnadseffektiv analyse av TME, der statistisk signifikant data kan genereres iceller uten systemiske variasjoner som oppstår i dyr.

Det er flere varianter av in vitro-systemer. De to mest brukte TME in vitro modeller består av blandet enkeltlag eller sfæroide cellekulturer. Begge kultur metoder er en fordel for grunnleggende studier av intercellulære interaksjoner (f.eks normale celler med kreftceller) og for analyse av ulike TME spesifikke celle fenotype endringer (for eksempel fremveksten av kreft-assosiert fibroblaster fra normale fibroblaster). I tillegg sfæroidene er i stand til å skape et mer reflekterende vev-lignende struktur av TME, og kan være representativ for tumor-heterogenitet ^23. Men kuler ofte produsere svært varierende oksygen spenning gradienter over lag, som kan komplisere eksperimentelle konklusjoner ^24. Dessverre er begge modellene svært begrenset i sin evne til å isolere rene cellepopulasjoner for videre karakterisering og studere følgende co-kultur. For å gjøre dette ville kreve minst én celletype for å være fluorescent-merket, eller merket med et identifikasjonstrakter, og deretter underkaste den blandede ko-kultur til omfattende behandling og cellesortering for å skille cellepopulasjoner. Mens en celle sorter er i stand til å isolere en ganske ren cellepopulasjon, må man være bevisst cellulært stress og potensiell mikrobiell kontaminasjon risikerer ^25.

For å lette forståelsen av inter kommunikasjon, har store anstrengelser vært viet til å utvikle og optimalisere in vitro systemer som tett etterligner in vivo miljø, samtidig som en tillater en forenklet tilnærming. Et slikt verktøy er gjennomtrengelig mikroinnsats, en membran substrat som først ble utviklet i 1953 ²⁶ og senere tilpasset for ulike applikasjoner og studier (f.eks celle polaritet ^27, endocytose ^28, narkotika transport ^29, vev modellering ^30, Fertilization ^31, Tilskuereffekten ^32,33, etc.). Dette systemet muliggjør vekst av celler med in vivo-lignende anatomisk og funksjonell differensiering, så vel som ekspresjon av mange in vivo markører ^34,35 som er ikke observert når de dyrkes på ugjennomtrengelig plasticware. Videre er det ekstremt tynn porøs membran (10 um tykk) tillater hurtig diffusjon av molekyler og ekvilibrering ganger, noe som simulerer in vivo miljø og tillater uavhengig cellulær funksjon ved både de apikale og basolaterale celle domener. En ytterligere fordel med innsatsens anvendelse som et TME system er dets fysiske separasjon av to heterotypic celle populasjoner dyrket på hver side av membranen i de samme miljøforhold, og samtidig opprettholde ulike former for intercellulær kommunikasjon gjennom membranporene. Selv om fysisk adskilt, er de to cellepopulasjoner metabolisk koplet via utskilte elementer og, som debeskrevet her, også gjennom gap-junctional kanaler. I tillegg, ved å opprettholde innsatsene ved in vivo partielle oksygenspenning (PO _2), reduserer modellen komplikasjoner av oksygen og kjemiske gradienter observert i andre systemer. Snarere, det øker forståelsen av naturlige mekanismer som styrer TME. Spesielt kan de to cellepopulasjoner kan lett isoleres med høy renhet, uten fluorescerende merking og / eller cellesortering etter lengre perioder med ko-kulturen.

Her beskriver vi en in vitro TME protokoll bestående av humane brystcancer-celler og humane fibroblaster dyrket, henholdsvis på hver sin side av en permeabel mikroporøs membran sette inn, men likevel i kontinuerlig toveis kommunikasjon gjennom membranporene. Vi viser at ved å bruke membraner med forskjellige porestørrelser, bidraget av en bestemt type av intercellulær kommunikasjon (f.eks utskilt faktorer versus gap junctions) til utviklingav TME kan undersøkes.

Protocol

1. Utarbeidelse av Culture Media og celler Fremstille 500 ml av Eagles minimale essensielle medium supplert med 12,5% (vol / vol) varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-alanyl-L-glutamin, og 100 enheter av penicillin og 100 ug streptomycin pr ml. MERK: vekstmedium og supplement (e) lett kan byttes for vekst hos andre cellestammer eller cellelinjer. Fremstille 70 ul av cellekulturmedium for hver innsats (6-brønns format innsats): Eagles minimum essensielt medium supplert med 50% (…

Representative Results

Her tilpasset vi en gjennomtrengelig mikro membran innsats for å utvikle en in vitro heterotypic celle co-kultur system som gjenspeiler in vivo svulstens mikromiljø (figur 1). Dette systemet gjør det mulig for to forskjellige cellepopulasjoner for å bli dyrket på hver side av innlegget er porøs membran i lengre tid (opp til 120 timer, i vår bruk). Viktigere systemet er i stand til å opprettholde renheten av cellepopulasjoner, som bestemt ved uts…

Discussion

Protokollen er beskrevet her er en enkel, tilpasningsdyktig in vitro prosedyre (figur 1) som benytter en gjennomtrengelig mikro membran innsats for å generere høyanriket enkelte cellepopulasjoner fra en co-kultur heterotypic celler. Betydelig, er modellen egnet til å undersøke ulike former for interkommunikasjon. De kritiske trinnene omfatter å velge den passende pore-størrelse innsats for spesifikk eksperimentell interesse (s), såing den første cellepopulasjon på undersiden av innsats…

Materials

For Cell Culture
AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast	Coriell	107661	Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line	PerkinElmer	119261	Parental line: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line	Cell Biolabs	AKR-201
Eagle's minimal essential medium (MEM)	Corning Cellgro	15-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified	Sigma	F6178-500mL
Corning Glutagro Supplement (200mM L-alanyl-L-glutamine)	Corning Cellgro	25-015-Cl
Penicillin Streptomycin Solution, 100X	Corning Cellgro	30-002-Cl
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore)	Costar	3450
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore)	Greiner bio-one	657610
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore)	Costar	3452
6-well Culture Plate	Greiner Bio-One Cellstar	657160-01
75 cm2 cell culture flask	CellStar	658 170
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1X	Corning Cellgro	21-040-CV	without calcium & magnesium
0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1X	Corning Cellgro	25-053-Cl
15 mL Centrifuge Tube	CellTreat	229411
35 x 10 mm Cell Culture Dish	Greiner bio-one	627 160
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Immunofluorescent Microscopy
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	In situ Immunofluorescence – 1:5000
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher Scientific	A-11029	In situ Immunofluorescence – 1:2000
Bovine Serum Albumin – Fraction V	Rockland	BSA-50	Immunoglobulin and protease free
16% (wt/vol) Formaldehyde Solution	ThermoFisher Scientific	28908	Dilute to 4% with 1X PBS
Premium Cover Glass (22×22 mm No.1)	Fisher	12548B
Triton X-100	Sigma	T8787-50ML
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	S36938
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Flow Cytometric Analysis
Calcein, AM	Molecular Probes	C3100MP
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-076
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Western Blot Analysis
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	Western Blot – 1:10000
Tween-20	BioRad	170-6531
Nitrocellulose Membrane (0.2 μm)	BioRad	162-0112
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL104001EA
BioRad DC Protein Assay	BioRad	500-0116
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	BioRad	161-0302
Sodium deoxycholate monohydrate (DOC)	Sigma	D5670
IGEPAL CA-630 (NP40)	Sigma	I8896
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	BioRad	161-0158