Murine flexor sene skade og reparer Surgery

Summary

Flexor sener i hånden er ofte skadet, noe som fører til nedsatt håndfunksjon. Imidlertid er det arr-vev healing respons ikke godt karakterisert. En murine modell av flexor sene healing er vist her. Denne modellen kan øke forståelsen av helbredelsesprosessen og vurdere terapeutiske tilnærminger for å forbedre helbredelse.

Abstract

Sene forbinder muskel-skjelettlidelser og bein, tilrettelegging bevegelse nesten hele kroppen. I hånden, flexor sener (FTS) mulig fleksjon av fingre og generell håndfunksjon. Skader i FTS er vanlig, og tilfredsstillende healing er ofte svekket på grunn av overflødig arrvev og sammenvoksninger mellom sene og omkringliggende vev. Men lite er kjent om de molekylære og cellulære komponenter i FT reparasjon. For dette formål er en murin modell av FT reparasjon som sammenfatter mange aspekter av helbredelse hos mennesker, inkludert svekket spekter av bevegelser og redusert mekaniske egenskaper, har blitt utviklet og tidligere beskrevet. Her en grundig demonstrasjon av denne kirurgiske prosedyren er gitt, innebærer tran og påfølgende reparasjon av flexor digitorum longus (FDL) sene i murine bakfot. Denne teknikken kan brukes til å gjennomføre avstamning analyse av forskjellige celletyper, vurdere virkningene av genet gevinst eller tap-av-funksjon, og for å teste effcacy av farmakologiske intervensjoner i helbredelsesprosessen. Imidlertid er det to primære begrensninger i denne modellen: i) FDL sene i midtpartiet av det murine bakpote, hvor det transeksjon og reparasjon forekommer, ikke er omgitt av en kappe synovial. Derfor er denne modellen tar ikke hensyn til det potensielle bidrag av kappen til arrdannelse prosessen. ii) For å beskytte integriteten av reparasjonsstedet, er FT utgitt på myotendinous krysset, redusere de mekaniske kreftene i senen, trolig bidra til økt arrdannelse. Isolering av tilstrekkelige celler fra granulasjonsvev av FT under tilhelingsprosessen for flowcytometrisk analyse har vist seg å være vanskelig; cytologi sentrifugering for å konsentrere disse cellene er en alternativ metode som brukes, og gir mulighet for generering av cellepreparater som immunofluorescerende merking kan utføres. Med denne metoden blir kvantifisering av celler eller proteiner av interesse under FT helbredelse mulig.

Introduction

Flexor sener i hånden arbeidet i konsert med flexor musklene i underarmen og digitale hylser for å muliggjøre fleksjon av sifrene og fatte funksjon av hånden. Flexor sener løpe langs håndflate-siden av hånden; denne relativt overfladisk stedet resulterer ofte i skader på flexor sener under traumer til hånden. Sener helbrede gjennom et arrvev respons i stedet for regenerering av normalt senevev ^en. Selv om dette arrvev gir kontinuitet til sene, er funksjonen dramatisk redusert i forhold til sunn sene. Sene-arrvev kompositter er preget av svekket mekaniske egenskaper ^1, gjengi de reparerte sener mer sannsynlig til å sprekke. I tillegg mangler arrvev organiseringen av det native sene kollagen fiberstruktur, noe som resulterer i en økning i størrelse sene og bulk. Gitt de anatomiske begrensninger av den sene-skjede enhet, selv en beskjeden økning i sene størrelse kan drastisk rødUCE den glidende funksjon i sene, og derfor sifret omfanget av bevegelse og håndfunksjon.

Før 1960-tallet skader flexor sener, spesielt de i sone II i hånden, ble ikke rutinemessig reparert på grunn av alvorlige komplikasjoner i healing som oppsto med disse reparasjonene ^2. Dette området av hånden ble referert til som "ingenmannsland" ^3. Men forbedringer i kirurgiske teknikker, sutur mønstre og fysioterapi rehabilitering protokoller har dramatisk forbedret utfall av flexor sene reparasjoner ^2. Til tross for disse fremskrittene, opptil 40% av reparasjoner resultere i tilstrekkelig vedheft formasjon for å hindre håndfunksjon ^4. Derfor er en biologisk metode som kreves for å forbedre helbredelsen. Dessverre, svært lite er kjent om den sene helbredelsesprosessen på cellulært og molekylært nivå. Således var målet å utvikle en murin modell som kan brukes for å forbedre den grunnleggende understanding av de cellulære og molekylære komponenter av flexor sene helbredelse og arrdannelse respons, som et middel til å identifisere nye terapeutiske mål å bedre healing.

Større dyremodeller har vært medvirkende i å fremme forståelse av flexor sene helbredelsesprosessen. Canine og kaninstudier har vist både den indre og ytre helbredende evne av flexor sener ^5,6, betydningen av tidlig kontrollert passiv bevegelse i å minimere adhesjonsdannelse i forhold til immobilisering ^7, så vel som virkningene av forskjellige sutur mønster på helbredelsesprosessen ^{8 , 9.} I tillegg har hundemodell vært nyttig ved testing av translasjonelle vev-tekniske metoder for å forbedre helbredelsen ^10. Imidlertid er det flere viktige fordeler i å bruke en murin modell i forhold til et stort dyremodell, inkludert den relative kostnad, tilgjengelighet av murine spesifikke reagenser, og den enkle å generere globalt Knock-outs eller vevsspesifikke sletting / overekspresjon konstruksjoner. Videre de funksjonelle likheter mellom mennesker og mus med hensyn til flexor sener ¹¹ indikerer potensielle nytten i å utvikle en murine modell.

Utvikling av en murine modell av flexor sene tran og reparasjon ligner mange aspekter av klinisk helbredelse, inkludert dannelsen av rikelig arrvev og nedskrevne mekaniske egenskaper. Modellen som er beskrevet her er ikke en ekte gjentagelse av klinisk praksis på grunn av tran av FDL på myotendinous krysset for å beskytte reparasjonsstedet. Videre gjør denne modellen ikke hensyn til bidraget av synovial-celler kappe for den helbredende respons, da det ikke er leddkappe som dekker midtpartiet av den sene hvor reparasjonen foregår. Til tross for disse begrensningene, har denne modellen fordelen av å generere omfanget av bevegelse begrensende voksninger, som ennå ikke er demonstrert i murine modeller at flere closely tilnærmet klinisk scenario. Denne modellen har blitt brukt til å vurdere knock-out musemodeller ^12,13, og for å teste ulike farmakologiske tilnærminger for å forbedre helbredelse ^14-17. Histologisk analyse av denne modellen, ved hjelp av immunhistokjemi og in situ hybridisering, kan gi viktig innsikt i til lokalisering av viktige gener og proteiner under healing. Imidlertid gir histologi bare et tverrsnitts romlige analyse og ikke tillater kvantifisering gjennom hele vev. Flowcytometri representerer en mer kvantitativ tilnærming, men bare et svært begrenset antall celler kan bli isolert fra den helbredende sene vev i musemodellen, og dette tall er ytterligere redusert i løpet av fikseringen, permeabiliseringen, og vasketrinn. Tar dette på kontoen, flowcytometri blir en unfeasible tilnærming på grunn av antall dyr som ville være nødvendig. En alternativ metode er nødvendig for å bevare de fleste av denne lille cellepopulasjonen i rekkefølgefor ytterligere å karakterisere den helbredende miljø. Metoden som brukes for å oppnå dette, er vist her, involverer konsentrasjon av de isolerte celler via cytologi sentrifugering på en glass-slide, etterfulgt av immunocytokjemi. I den foreliggende undersøkelse EDU (5-etynyl-2'deoxyuridine, en tymidinanalog) inkorporering og påfølgende merking ble anvendt for å bestemme den relative proliferativ tilstand av celler ved helbredelse området. Denne tilnærmingen kan brukes for å teste effektiviteten av farmakologiske behandlinger på celleformering, gene knock-out eller overekspresjon, eller for å identifisere og kvantifisere forskjellige cellepopulasjoner.

Protocol

The University Committee on Animal Forskning ved University of Rochester godkjent alle dyreforsøk. Ti 12 uker gamle hunn C57BL / 6J mus ble anvendt. 1. Utarbeidelse av dyr for flexor sene Surgery (~ 15 min) Autoklaver kirurgiske instrumenter til å sterilisere, slitasje sterile hansker hele, og opprettholde et sterilt operasjonsfelt. Bedøve mus via intraperitoneal injeksjon (ip) med et volum av ketamin (80 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg), tilsvarende kroppsvekt. Bekre…

Representative Results

Flexor digitorum longus (FDL) muskel, som ligger i leggen, virker til å bøye sifrene i mus hind labben via bøyesenen (markert i blått i figur 1A, og vist histologisk i figur 2A), som går proksimalt fra myotendinous krysset og ender i de distale falanger. I denne modellen av flexor sene helbredelse, er FDL sene transektert og reparert ved midten av foten, proksimalt til forgreningen i til sifrene i bakpoten (røde piler, figur 1A). F…

Discussion

Den kirurgiske prosedyre for en murin modell av fullstendig transeksjon og reparasjon av flexor digitorum longus sene er presentert i denne studien. I tillegg er en ny anvendelse for å konsentrere små cellepopulasjoner med cytologi sentrifuge er vist, slik at for kvantitativ immuncytokjemisk analyse av det cellulære miljø i løpet av flexor sene helbredelse. Denne modellen av bøye sene reparasjon viser en reproduserbar helbredende respons, som kan brukes til å vurdere endringer i helbredelsesprosessen ved bruk av …

Materials

Surgical preparation
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	000664
Ketamine	Hospira	NDC# 0409-2051-05
Xylazine	Lloyd Inc.	NDC# 61311-482-10
Buprenorphine	Par Pharmaceutical Inc.	NDC# 42023-179-10
0.9% sodium chloride irrigation	Hospira	NDC# 0409-6138-03	For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions
1ml syringe	BD	309659
30G needle	BD	305106
Povidone-Iodine solution	Aplicare	82-226
70% ethanol
Puralube vet opthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	NDC# 17033-211-38
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tools
Portable balance 200g	Ohaus	SP202
Spring scissors	Fine Science Tools	15124-12
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30
Needle holders	Fine Science Tools	91201-13
Micro spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Micro needle holders	Fine Science Tools	12061-02
5-0 nylon sutures	Ethicon	668G
8-0 microsurgery nylon sutures	Ethicon	2808G
Lab-Line histology slide warmer	Barnstead International	26025
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytospin method
Collagenase Type I, lyophilized	Life Technologies	1700-017
Bovine Serum Albumin	Cell Signaling Technologies	9998S
1X PBS	Thermo Fisher	10010-023
Cytology funnels	Fisher HealthCare	10-354
HistoBond+ microscope slides	VWR	16005-110
Cytospin 2 centrifuge	Shandon	SH-CYTO2
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunocytochemistry
Slide staining tray with black lid	IHC World	M920-2
Click-iT Plus EdU Imaging Kit	Life Technologies	C10639	Includes EdU and  Hoeschst 33342
Immedge hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
ProLong Diamond mounting medium	Thermo Fisher	P36970
Glass coverslips 24x50mm #1.5
Clear nail polish