Neurale stamceller (NSC) refererer til celler, som kan forny sig selv og differentiere til de tre neurale slægter. Her beskriver vi en protokol til at bestemme NSC frekvens i en given celle population ved hjælp neurosfære dannelse og differentiering under klonede betingelser.
Neurale stamceller (NSC) har evnen til at forny sig selv og generere de tre store neurale slægter – astrocytter, neuroner og oligodendrocytter. NSC'er og neurale stamceller (NPS) er almindeligvis dyrkes in vitro som neurosfærer. Denne protokol beskriver i detaljer, hvordan at bestemme NSC frekvensen i en given celle population under klonede betingelser. Protokollen begynder med podning af cellerne ved en densitet, der muliggør frembringelsen af klonale neurosfærer. Neurosfærerne overføres derefter til kamre dækglas og differentieres under klonale forhold i konditioneret medium, som maksimerer differentieringen potentiale neurosfærer. Endelig er NSC frekvens beregnes på basis af neurosfære dannelse og multipotency kapaciteter. Værker af denne protokol omfatter en evaluering af kandidat NSC markører, oprensning af NSC'er, og evnen til at skelne NSC'er fra NP'er. Denne metode tager 13 dage at udføre, hvilket er meget shorter end nuværende fremgangsmåder til optælling NSC frekvens.
Neurale stamceller (NSC) er celler i centralnervesystemet (CNS), der kan forny sig selv og er multipotente. NSC er først angivet under udviklingen af den embryonale forhjernen og fortsætte med at forblive i den voksne hjerne på bestemte områder såsom subventrikulære zone (SVZ) i de laterale ventrikler og gyrus dentatus (GD) i hippocampus. Et antal NSC linjer bliver brugt i kliniske forsøg til behandling af slagtilfælde og andre neurologiske sygdomme, såsom Batten sygdom 1.
NSC og neurale stamfædre (NPS) opformeres i kultur som flydende 3-dimensionelle sfæroide strukturer kaldet neurosfærer. Neurosfæren dyrkningssystemet udviklet af Reynolds og Weiss i begyndelsen af 1990'erne, da de fandt, at embryonale og voksne corticale celler kunde dele i nærvær af epidermal vækstfaktor (EGF) og basal fibroblastvækstfaktor (bFGF) 2-4. Neurosfærer består af en heterogen blanding af calen bestående af underklasser på forskellige udviklingsstadier 5. Det er en udfordring at specifikt studere NSC'er anvende oplysninger fra neurosfærer grund af tilstedeværelsen af NP'er. Derfor er det afgørende at berige NSC'er fra neurosfærer. På nuværende tidspunkt er fire vigtigste metoder blevet anvendt til at berige for NSC'er in vitro. Første er anvendelsen af celleoverflademarkører. Lewis-X (LeX) og CD133 (også kendt som Prominin1) er de mest fremtrædende celleoverflade NSC markører 6-9. Syndecan-1, Notch-1 og Integrin-beta1 er andre overfladeproteiner, der beriger for NSC'er 10. Andet er farvestoffet udstødelse. Det er blevet vist, at de side-population-celler, som har den unikke evne til at pumpe den fluorescerende DNA-bindende farvestof Hoechst 33342, er beriget med NSC'er 11. Tredje er anvendelsen af morfologisk udvælgelse. Det er blevet påvist, at celler med øget cellestørrelse og granularitet havn mere NSC'er end deres kolleger 5,12,13. Fjerde er tilføjelsen af NSC survival faktorer til dyrkningsmediet. Det er blevet vist, at tilsætning af Chondroitinsulfat proteoglycan og Apolipoprotein E forbedrer NSC overlevelse og dermed øger NSC frekvens 14,15. Selvom mange markører, herunder transkriptionsfaktorer har været forbundet med NSC'er 16,17, ingen af disse markører er i stand til at berige NSC'er til renhed. På grund af manglen på en endelig NSC markører, er det fortsat en udfordring at kvantificere NSC'er og skelne dem fra nationale parlamenter in vitro.
Indledende undersøgelser anvendte neurosfæren dannelse assay (NFA) at kvantificere NSC'er 7,11,13. I dette assay dissocierede celler dyrkes til dannelse neurosfærer og antallet af neurosfærer genereret for hver 100 udpladede celler bestemmes. Denne værdi betegnes som neurosfæren Formation Unit (NFU). NFU er lig med NSC frekvens, hvis alle neurosfærer skyldes NSC'er. Imidlertid blev det vist, NFU overvurderer NSC frekvens som neurosfærer dannet af begge NSCs og begyndelsen NP'er fem. Således er det forkert at opregne NSC'er udelukkende baseret på neurosfære-formation. Det kunne være muligt at kvantificere NSC'er baseret på deres evne til selv at forny, formere udførligt og generere multipotente neurosfærer.
NSC, som er EGF og bFGF lydhør, normalt overleve i mindst ti passager og dermed vise omfattende selvfornyelse kapacitet i kultur 4,18-20. Nationale parlamenter, som er EGF og bFGF lydhør samt, kunne også generere neurosfærer for nogle få passager, men ikke for en længere periode. Derfor er det blevet almindeligt accepteret, at bona fide NSC kan opregnes med rimelig nøjagtighed baseret på neurosfære dannelse i mindst ti passager. I de fleste undersøgelser har imidlertid selvfornyelse måles normalt baseret på sekundær eller tertiær neurosfære dannelse grund af den lange tid, der kræves eksperimentelle ti passager. Derfor kan den sekundære NFA anvendes til stort set sammenligne selvfornyelse evne between populationer, men kan ikke anvendes til nøjagtig optælle NSC frekvens.
NSC har en større proliferativ evne sammenlignet med NP'er. Denne egenskab af NSC blev brugt af Louis et al. at udvikle et assay for NSC tælling – den neurale kolonidannende celleassay (NCFCA) 21,22. I dette assay enkelte celler er dyrket i 3 uger i en collagen-holdig halvfast matrix. Under disse dyrkningsbetingelser blev det vist, at celler, der danner neurosfærer over 2 mm i diameter er tripotent og kan forny sig selv for langsigtet. Disse celler er defineret som NSC'er. Derfor er NSC'er effektivt skelnes fra NP'er.
NSC har evnen til at differentiere til astrocytter, oligodendrocytter og neuroner. For differentiering af neurosfærer, er vækstfaktorer fjernes og serum sættes til dyrkningsmediet. Hvis der observeres alle tre neurale slægter i en neurosfære, så den celle, indledte at neurosfære is en NSC. Imidlertid differentieringen assayet har visse begrænsninger. For det første kan de dyrkningsbetingelser, der anvendes til differentiering ikke optimale til generering af alle tre neurale cellelinier. Faktisk i en enkelt neurosfære differentiering proces, signifikant celledød indtræffer og hovedsagelig astrocyt generation forekommer (Tham M og Ahmed S, ikke publiceret). For det andet er der spørgsmålet om klonalitet. For nøjagtig tælling af NSC, dannelse og differentiering af neurosfærer skal udføres under klonede forhold, hvor hver neurosfære opstår fra en enkelt celle. I bulk-suspensionskulturer, aggregering forekommer ved både cellulære og neurosfære niveauer 23-25. Derfor er det muligt for hver neurosfære at hidrøre fra flere celler eller neurosfærer, hvilket komplicerer neurosfære optælling og evaluering af multipotency. Nye beviser viser, at aggregering af celler ikke forekommer ved lav udpladningsdensitet på 0,5 celler / pi eller derunder og når dyrkningsplader ikke flyttes under neurosphere formation 15. Således at dyrke celler på en sådan lav densitet vil sikre klonalitet.
I øjeblikket er NCFCA er den mest anvendte metode til at skelne NSC'er fra NP'er og opregne NSC frekvens. The NCFCA, kræver imidlertid en relativ lang tid på tre uger. Her beskriver vi en protokol til at optælle NSC frekvens baseret på evnen af NSC at danne multipotente neurosfærer. Denne protokol tager kun 13 dage at udføre. Den NCFCA sikrer klonalitet som kollagenmatrixen forhindrer bevægelse af neurosfærer. De dyrkningsbetingelser, der anvendes i denne protokol tillader også klonalitet skal føres i hele. For eksempel brugen af 50-brønd kamre dækglas sikrer, at neurosfærer vil differentiere uden at kontakte hinanden. Ydermere benyttes konditioneret medium, der leverer neurotrofiske faktorer under differentiering at maksimere differentiering potentiale neurosfærerne (figur 1).
Vi beskriver hee opregningen af NSC'er under klonede betingelser. Kritiske trin indbefatter anvendelsen af frisk NSC vækst og differentiering medium, og også anvendelsen af frisk fremstillet PLL / laminin opløsning til at overtrække kamre dækglas, samt dyrkningsskålene. Dette sikrer optimale vækst- og differentieringsfaktorer betingelser for neurosfærer. Anvendelsen af god kvalitet antistoffer til effektivt at detektere de neuroner og glia, samt den selektive plukning af klonale neurosfærer, som ikke er i kontakt med andre neurosfærer, er kritiske. Endvidere er det vigtigt at sikre de plukkede neurosfærer ikke tørrer ud. Det anbefales at tilføje 10 uL af differentiering medium til hver brønd efter plukningen hver 10 neurosfærer. Det er vigtigt at bruge en kamre dækglas i en 10 cm skål per prøve at undgå krydstale mellem neurosfærer fra forskellige prøver. Hvis to dækglas (der hver indeholder neurosfærer fra forskellige prøver) er anbragt isamme 10 cm skål, kan neurosfærer fra én dækglas frigive faktorer, der kan ændre tilbøjelighed neurosfærer i den anden dækglasset til at differentiere til specifikke afstamninger. To dækglas i samme 10 cm skål kan også resultere i blanding op mellem prøver.
I tilfælde NFU eller NSC frekvens er lavere end forventet, at lav passagenummer neurosfærer anvendes. Det er også vigtigt, at sunde lavpassage neurosfærer anvendes til generering konditioneret medium. Hvis dernæst neurosfærerne dyrkes i brønde med lille diameter, såsom i 96-brønds skål, så vil det være vanskeligt at manøvrere og bryde neurosfærer anvendelse af en mikropipette. I dette tilfælde, overføre neurosfærer til et større dyrkningsskål, såsom en 6-brønds skål, før plukning. Nogle af de plukkede neurosfærer kan løfte fra kamre dækglas under dyrkning og immunfarvning. Minimering af bevægelsen af kamre dækglas under dyrkning, og mindre intensiv vasking under immunfarvning, vil bidrage til at undgå frigørelse af neurosfærer.
Indledende undersøgelser kvantificeres NSC'er kun med NFA 7,11,13. Men NFA overvurderer, NSC frekvens som både NSC'er og tidlige NP'er generere neurosfærer 5. Louis et al. Udviklet en anden metode til at kvantificere NSC'er kendt som NCFCA 21,22. Den NCFCA involverer dyrkning enkelte celler i en kollagenbaseret matrix at sikre klonalitet, og det blev vist, at neurosfærer over 2 mm i diameter dannes af kun NSC'er. Svarende til NCFCA, er klonalitet sikres i hele denne protokol. Dette opnås ved at generere neurosfærer ved klonal densitet og differentiering af neurosfærer i kamre dækglas. Anvendelsen af kamre dækglas giver en række fordele. Den kamre dækglas tillader hver prøve neurosfære at differentiere uden at have fysisk kontakt med andre prøve neurosfærer og dermed sikre klonalitet under differentiering.Den kamre dækglas kan placeres ophængt på differentiering medium til Lad prøven neurosfærer skal løbende konditioneres og for at sikre maksimal differentiering. I fravær af konditioneret medium og serum under differentiering, overlevelse neurosfærer falder, og neurosfærerne meste generere astrocytter (Tham M og Ahmed S, ikke offentliggjort). Desuden kan de immunfarvet neurosfærer bekvemt opbevares i længere tid og de kamre dækglas kan monteres direkte på mikroskopet objektglas. Derudover er billeddannelse af de immunfarvet neurosfærer nemt som man hurtigt kan finde neurosfære i den lille kamre godt, tage et billede, og gå videre til den næste brønd.
Vi har bestemt NSC frekvens i E14.5 mus neurosfære kultur ved hjælp af både protokollen beskrevet i dette manuskript 27 og NCFCA 28. NSC frekvens i E14.5 mus neurosfærer bestemt af både migthods er sammenlignelige. Den NCFCA opregner NSC'er der er multipotente og har langsigtede selvfornyelse kapacitet. Da NSC frekvens fra vores metode kan sammenlignes med, at der fra NCFCA, er udlæsningen fra vores protokol ikke at overvurdere NSC frekvens. Den NCFCA kræver tre uger, der skal udfyldes og hovedsagelig involverer celleudpladning og mellemstore genopfyldning. Protokollen beskrevet her kræver 13 dage til at udføre og involverer en anden række trin, fx neurosfære plukning og immunfarvning. Denne protokol kunne tjene som en alternativ metode til at opregne NSC'er. Forskere kan bruge både NCFCA og denne protokol til at kontrollere NSC frekvens i deres prøver.
En begrænsning af denne protokol er, at en række vigtige skridt skal alle udføres på dagen 8. Forberedelsen af konditioneret medium, bestemmelse af NFU af prøven neurosfærer, og overførsel af prøven neurosfærer til 50-godt kamre dækglas skal være udført på day 8. Man kunne tage tid at udføre disse trin. Desuden kræver det praksis at udføre disse trin på en effektiv måde.
Neurosfærer er ofte blevet brugt til at studere NSC funktion og adfærd. Men neurosfærer består af både NSC'er og NP'er. Derfor er det vigtigt at berige NSC'er fra neurosfærer at studere NSC biologi. I øjeblikket har celleoverflademarkører, farveeksklusion ejendom og til cellestørrelse og granularitetskravene blevet anvendt til at berige for NSC'er 6,7,9-13,29,30. Denne protokol kan bruges til at kvantificere berigelse NSC'er potentielle NSC markører, og for at lette søgningen efter en endelig NSC markør. Fire nylige undersøgelser har brugt denne protokol at optælle NSC frekvens 5,14,15,26.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker agenturet for Videnskab, Teknologi og Forskning (A * STAR), Singapore for at finansiere denne forskning.
15 ml conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
50 ml conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
20 ml sterile syringe | BD | 300141 | |
50 ml sterile syringe | BD | 300144 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
Human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
1.0 N Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
Bovine serum albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
B27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
1x phosphate buffered saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
Cell culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
CO2 incubator | |||
Ventilated fume hood | |||
Aspirator | |||
Confocal microscope | |||
Micropipettes | |||
Micropipette tips | |||
Plastic pipettes | |||
Multichannel pipettes | |||
Glass beaker | |||
Sterile forceps | |||
pH meter |