Instrueret Protein Emballage inden ydermembranvesikler fra<em> Escherichia coli</em>: Design, produktion og oprensning

Summary

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Abstract

En stigende interesse i at anvende syntetisk biologi teknikker til at programmere ydre membran vesikler (OMV) fører til nogle meget interessante og unikke applikationer til OMV hvor traditionelle nanopartikler beviser for svært at syntetisere. Til dato har alle gramnegative bakterier vist sig at producere OMV demonstrerer emballering af en række af last, der omfatter små molekyler, peptider, proteiner og genetisk materiale. Baseret på deres forskelligartede fragt, er OMV impliceret i mange biologiske processer lige fra celle-celle-kommunikation til genoverføring og levering af virulensfaktorer afhængig af hvilken bakterier producerer OMV. Først for nylig har bakteriel OMV blevet tilgængelige til brug på tværs af en bred vifte af applikationer gennem udvikling af teknikker til kontrol og direkte pakning af rekombinante proteiner i OMV. Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til fremstilling, oprensning og anvendelse af enzym emballeret OMV fastlæggelse af forbedret overall produktion af rekombinant enzym, øget blæredannelse, og øget enzym stabilitet. Vellykket anvendelse af denne protokol vil resultere i skabelse af en bakteriestamme, der samtidig producerer et rekombinant protein og dirigerer det til OMV indkapsling ved at skabe en syntetisk binding mellem det rekombinante protein og en ydre membran anker-protein. Denne protokol beskriver også metoder til isolering OMV fra bakteriekulturer samt ordentlig håndtering teknikker og ting at overveje, når at tilpasse dette protokol til brug for andre unikke applikationer såsom: farmaceutiske stof levering, medicinsk diagnostik, og udbedring af miljøskader.

Introduction

Præsenteret her er en metode til design, produktion og oprensning af enzym-loaded bakterielle ydre membran vesikler (OMV). OMV er små, primært unilamellære, proteoliposomer, der varierer i størrelse fra 30-200 nm ^1,2. Alle Gram-negative og Gram-positive bakterier, der er blevet undersøgt til dato har vist frigivelse af enten OMV eller ekstracellulære vesikler (EV) fra deres overflade ^3,4. Den præcise mekanisme, hvorved OMV produceres endnu ikke er fuldstændigt belyst på grund af de forskellige bakterielle populationer, der secernerer dem samt de varierende funktioner som de betjener. OMV har vist sig at transportere en bred vifte af gods fra små molekyler, peptider og proteiner til genetisk materiale betjener en række komplekse signalering, gen translokation, og virulens fungerer ^5,6.

De nøjagtige mekanismer OMV biogenese er ikke godt karakteriseret, og synes at variere mellem bakteriearter. trods this Faktisk har vi udviklet en fremgangsmåde til forøgelse af emballagen effektiviteten af ​​et rekombinant protein i OMV ved at skabe en syntetisk binding mellem et protein af interesse og en højt rigelige protein endogent for den bakterielle ydre membran og efterfølgende OMV. I mangel af en syntetisk binding, eller kunstigt inkorporeret affinitet mellem det rekombinant udtrykte protein og OMV den observerede emballage effektivitet er meget lav ^7. Dette resultat er forventeligt som inkorporering af proteinerne i OMV enten sker gennem tilfældig chance indkapsling på det præcise tidspunkt for OMV dannelse på den bakterielle overflade eller gennem rettet emballage ved mekanismer, der ikke er godt forstået. er blevet observeret en vis succes i emballage proteiner blot ved overekspression i det periplasmiske rum, der er afhængig af tilfældig chance indkapsling men effektiv emballage er meget afhængig med nogle proteiner emballage ved høj effektivitet protein i forhold til andre thved ikke pakke overhovedet ^8-10. Ved at udnytte fælles syntetisk biologi teknikker søgte vi at ingeniør Escherichia coli (E. coli) til samtidig at producere, pakke og udskiller et aktivt enzym af interesse i OMV, der omgår nuværende begrænsninger viden om, hvordan OMV dannes, og hvordan lasten er valgt af bakterierne for emballering.

Med henblik på denne ansøgning blev en split protein bioconjugation-system valgt som den syntetiske sammenkædning af valg for at lette retningsbestemt emballage i OMV. Som navnet antyder en split protein bioconjugation Systemet består af to komplementære subunit domæner, der interagerer med hinanden. De split proteindomæner udvalgt med henblik på denne protokol, er benævnt spycatcher (SC) og SpyTag (ST) domæne og er afledt af Streptococcus pyogenes fibronectin-bindende protein (FbaB) ^11. Denne opdeling protein system er usædvanligt i, at whøne de to underenheder er inden nærhed en isopeptidbinding spontant danner mellem den proximale asparaginsyre og lysin aminosyrerester skaber en kovalent binding. Isopeptidbinding dannelse kræver ikke tilsætning af chaperoneproteiner, katalytiske enzymer eller cofaktorer og kan let forekomme ved stuetemperatur (RT) og over et bredt område af fysiologisk relevante betingelser ^12.

Som en proof of concept, blev phosphotriesterase (PTE) (EF 3.1.8.1) fra Brevundimonas diminuta udvalgt til at være pakket ind i E. coli stammer OMV ^13. PTE indeholder en Binuclear Zn / Zn aktive sted og har evnen til at nedbryde organophosphater gennem en hydrolysereaktion omdannelse aryldialkylphosphates i dialkylphosphates og arylalkoholer ^14. Udsættelse for organofosfater forringer ordentlig neurotransmitter funktion gennem hæmme hydrolyse af acetylcholin ved acetylcholinesterase ved neuromuskulære junctions Making organophosphat afledte forbindelser ekstremt farlige ^15. Langvarig eller betydelig udsættelse for organofosfater almindeligvis resulterer i ukontrollable kramper og typisk forårsager dødsfald via kvælning. Mens PTE udviser den højeste katalytiske aktivitet over paraoxon, en meget potent insekticid, er det også i stand til at hydrolysere et bredt udvalg af andre pesticider og V / G typen kemisk nervemidler ^16. For at lette OMV emballage blev et bakterielt plasmid konstrueret, som koder for en genkonstruktion, der indeholder en inducerbar promotor, en periplasmatisk lokalisering sekvens, og en kort multipelt kloningssite opstrøms for SC gensekvens. Insertion af PTE genet mellem lederen og SC-sekvens tillod etablering af en genetisk switch, der er målrettet mod PTE-SC fusionsproteinet til det periplasmatiske rum for OMV emballage. Mens den indsats, der er beskrevet her fokusere på PTE, enzymgenet er udskiftelige og kan let erstattes med et andet gen-sekvens med FACilitate emballering af en alternativ enzym eller protein.

Som den anden del af den syntetiske kobling, er en rigelig ydre membran protein (OmpA) valgt at præsentere ST peptidsekvensen. Mens valget af anker-protein kan variere, er det vigtigt, at proteinet har en eftergivende domæne, der præsenterer inden det periplasmatiske rum, tolererer fusionskonstruktionen uden at inducere cytotoksicitet, er kendt for at være til stede i OMV, og ikke aggregerer, når det er rekombinant produceret. OmpA er et 37,2 kDa transmembran porin protein, der er kendt for at være højt udtrykt i den bakterielle ydre membran og efterfølgende OMV ^17. Det er impliceret i transporten af små molekyler, <2 nm i størrelse, på tværs af bakterielle membran ^18. Native OmpA har to strukturelt unikke domæner, en transmembran beta barrel motiv og en periplasmisk opløseligt C-terminale del vides at interagere med peptidoglycan ^19. I mutanten OmpA-ST fusion designed her den C-terminale del af OmpA blev slettet og ST blev fusioneret til den periplasmisk vendende N- eller C-terminale ender. Sletning det periplasmiske del af OmpA nedsætter antallet af interaktioner mellem den ydre membran og peptidoglycan resulterer i membranen destabilisering fører til hyper-vesikulation ^7. Genomisk OmpA blev opretholdt ud over det rekombinant udtrykte OmpA-ST-konstruktionen at afbøde brutto membran destabilisering.

Protocol

1. Fremstilling af plasmider Forbered et plasmid (f.eks pET22), der indeholder ankeret protein (OmpA) fusioneret til en bi-ortogonal sammenkædning domæne (der henvises til i denne protokol som anker-ST), epitop-mærke (såsom 6xHis, myc eller FLAG tags for rensning og identifikation), periplasmiske lokalisering tag, antibiotikaresistens, og passende replikationsstartområde baseret på den valgte bakteriestamme 7. Uddrag plasmid-DNA fra overnatskulturer under anvendelse af et ko…

Representative Results

Samtidig ekspression af to rekombinante proteiner, som er nødvendig for OMV emballagestrategi beskrevet i denne protokol, kan opnås gennem en række forskellige veje. Her blev en to vektor-system med kompatible replikationsoriginer og separate inducerbare genkassetter. Til ekspressionen af ​​PTE-SC konstruere en kommerciel plasmidskelet (pACY184) blev manipuleret til at indeholde en arabinose inducerbar genkassette og en dobbelt arginin periplasmisk lokalisering ledersekvensen efte…

Discussion

This protokolfunktioner at demonstrere en repræsentativ rettet emballage teknik, hvor et enzym af interesse produceres og pakkes i OMV ved E. coli. Som med mange komplekse teknikker der er flere områder, hvor protokollen kan modificeres til at rumme til brug i forskellige unikke applikationer, hvoraf nogle er beskrevet nedenfor. Mens den mekanisme af OMV emballage og enzym indkapsling kan tilpasses specifikke behov der er flere trin i denne protokol, som er afgørende for dens succes. Den indledende fjernelse…

Materials

IPTG	Any		Always prepare fresh or aliquot and freeze.
L-arabinose	Any		Can be prepared ahead of time and stored at 4C.
Ampicillin	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
Chloramphenicol	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
TB/LB Culture Media	Any		Other growth medias will likely work similarly.
Triton X-100	Any		One of many potential suitable surfactants.
Baffled culture flasks	Any		The baffles promote higher levels of aeration.
CHES	Fisher Bioreagents	BP318-100	Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8).
Paraoxon	Chem Service	N-12816	Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.
Syringe Filter 0.45 µm	Thermo Scientific	60183-221       (30 mm)	Filter diameter will depend on volume of sample.  Low protein binding membrane is critical.
Shaker incubator	New Brunswick	Excella E24	Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.
Sorvall Culture Centrifuge	Thermo Scientific	RC 5B PLUS	Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g.
Sorvall Ultracentrifuge	Thermo Scientific	WX Ultra 90	Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g.
Ultracentrifuge Rotor	Thermo Scientific	AH-629	Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.
Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes        (25 x 89 mm)	Beckman Coulter	344058	Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.
Spectrophotometer	Tecan	Infinite M1000	Necessary for enzyme kinetic assays.
DLS / particle tracking	NanoSight	LM10	Necessary for OMV size distribution and concentration determination.
BL21(DE3)	NEB		Suitable bacterial expression strain.
pET22	EMD Millipore	69744-3	Other plasmids can be used in place of these.
pACYC184	NEB		Other plasmids can be used in place of these.
Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Example kit.