Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln<em> Escherichia coli</em>: Entwurf, Herstellung und Reinigung

Summary

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Abstract

Eine zunehmende Interesse der synthetischen Biologie-Techniken bei der Anwendung der äußeren Membran Vesikel (OMV) zu programmieren, führen zu einigen sehr interessanten und einzigartigen Anwendungen für die OMV, wo traditionelle Nanopartikel zu schwierig erweisen zu synthetisieren. Bis heute sind alle gramnegativen Bakterien wurde gezeigt, OMV Demonstrieren Verpackung einer Vielzahl von Ladung zu erzeugen, die kleine Moleküle, Peptide, Proteine ​​und genetische Material enthält. Auf der Grundlage ihrer unterschiedlichen Ladung, sind OMV in vielen biologischen Prozessen beteiligt im Bereich von Zell-Zell-Kommunikation zu Gentransfer und Lieferung von Virulenzfaktoren abhängig davon, welche Bakterien die OMV produzieren. Erst vor kurzem haben bakterielle OMV für den Einsatz in einem breiten Spektrum von Anwendungen durch die Entwicklung von Techniken zugänglich zu steuern und direkte Verpackung von rekombinanten Proteinen in die OMV. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung, Reinigung und Verwendung von Enzym verpackt OMV zur Bereitstellung verbesserter Marktpreisefürll Herstellung von rekombinanten Enzyms erhöht Vesikulation und verbesserte Enzymstabilität. Erfolgreiche Nutzung dieses Protokolls wird in der Schaffung einer Bakterienstamm führen, die gleichzeitig ein rekombinantes Protein produziert und leitet sie für OMV Verkapselung durch eine synthetische Bindung zwischen dem rekombinanten Protein zu schaffen, und eine äußere Membran-Ankerproteins. Dieses Protokoll beschreibt auch Verfahren zur Isolierung von OMV aus Bakterienkulturen sowie für eine angemessene Handhabung Techniken und Dinge zu berücksichtigen, wenn dieses Protokoll für den Einsatz für andere einzigartige Anwendungen wie Anpassung: pharmazeutische Drug Delivery, medizinische Diagnostik und Umweltsanierung.

Introduction

Dargestellt ist hier ein Verfahren für die Konstruktion, Herstellung und Reinigung von Enzym-beladenen bakterielle äußere Membranvesikel (OMV). OMV sind klein, vor allem unilamellare, Proteo , die von 30 bis 200 nm ^1,2 in einem Größenbereich. Alle Gram-negative und Gram-positive Bakterien , die bisher untersucht wurden , haben gezeigt , Freisetzung von entweder OMV oder extrazelluläre Vesikel (EV) von ihrer Oberfläche ^3,4. Der genaue Mechanismus, durch den OMV produziert haben noch voll auf Grund der unterschiedlichen Bakterienpopulationen aufgeklärt werden, dass sie so gut wie die unterschiedlichen Funktionen ausscheiden, die sie dienen. OMV wurden , um eine breite Palette von Fracht aus kleinen Molekülen, Peptiden und Proteinen an genetischem Material dazu dient , eine Vielzahl von komplexen Signal, Gen – Translokation zu transportieren gezeigt, und Virulenzfunktionen ^5,6.

Die genauen Mechanismen der OMV Biogenese sind nicht gut charakterisiert, und scheinen zwischen Bakterienarten zu unterscheiden. Trotz this der Tat haben wir ein Verfahren zur Steigerung der Verpackungseffizienz eines rekombinanten Proteins in OMV entwickelt durch eine synthetische Bindung zwischen einem Protein von Interesse und eine hoch reichlich Protein endogen der bakteriellen äußeren Membran und anschließende OMV entsteht. In Abwesenheit eines synthetischen Bindung oder künstlich eingearbeitet Affinität zwischen dem rekombinant exprimierten Protein und der OMV die beobachtete Verpackungseffizienz sehr niedrig ^7. Dieses Ergebnis ist in dem Augenblick der OMV Bildung an der Bakterienoberfläche oder durch gerichtete Verpackung durch Mechanismen, die nicht gut verstanden sind innerhalb der OMV erfolgt entweder durch Zufall Verkapselung als Einbau der Proteine ​​zu erwarten. Ein gewisser Erfolg wurde in Verpackungsproteine ​​einfach durch Überexpression in den periplasmatischen Raum beobachtet worden, die auf zufällige Chance Verkapselung, aber effektive Verpackung setzt eine hohe Proteinabhängig mit einigen Proteinen mit hohem Wirkungsgrad Verpackung im Vergleich zu anderen tham Do Paket nicht mehr ^8-10. Durch die Verwendung von gemeinsamen synthetischen Biologie – Techniken haben wir versucht , Escherichia coli (E. coli) zu konstruieren , ein aktives Enzym von Interesse in OMV gleichzeitig produzieren, verpacken und ausscheiden, die derzeitigen Kenntnissen Beschränkungen hinsichtlich umgeht , wie OMV gebildet werden und wie Ladung durch die Bakterien ausgewählt ist für Verpackung.

Für die Zwecke dieser Anmeldung ein Split-Protein Biokonjugation System wurde als der synthetische Verknüpfung der Wahl ausgewählt Richtungs Verpackung in das OMV erleichtern. Wie der Name schon ein Split-Protein Biokonjugation System schlägt besteht aus zwei komplementären Untereinheit Domänen, die miteinander interagieren. Die geteilten Proteindomänen für die Zwecke dieses Protokoll ausgewählt werden als die SpyCatcher (SC) und SpyTag (ST) Domäne und aus dem Streptococcus pyogenes Fibronektin-bindenden Protein (FbaB) ¹¹ abgeleitet werden. Diese Spaltung Proteinsystem ist ungewöhnlich, dass when die beiden Untereinheiten innerhalb der Nähe sind eine Isopeptidbindung bildet sich spontan zwischen dem proximalen Asparaginsäure und Lysin Aminoreste Säure eine kovalente Bindung zu schaffen. Isopeptidbindung Bildung erfordert nicht die Zugabe von Chaperon – Proteinen, katalytische Enzyme oder Cofaktoren und kann bei Raumtemperatur (RT) und über einen weiten Bereich von physiologisch relevanten Bedingungen ¹² leicht auftreten.

Als Beweis des Konzeptes wurde Phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) aus Brevundimonas diminuta ausgewählt in E. coli ¹³ OMV abgeleitet verpackt werden. PTE enthält einen zweikernigen Zn / Zn aktiven Stelle und hat die Fähigkeit , Organophosphate durch eine Hydrolysereaktion zu brechen aryldialkylphosphates in Dialkylphosphate und arylalkohole Umwandlung ^14. Die Exposition gegenüber Organophosphaten beeinträchtigt richtige Neurotransmitterfunktion durch die Hydrolyse von Acetylcholin durch Acetylcholinesterase bei neuromuskulären Verbindungen Hemmung Making Organophosphat abgeleiteten Verbindungen extrem gefährlich ^15. Längerer oder signifikante Exposition gegenüber Organophosphaten führt häufig zu unkontrollierbaren Zuckungen und in der Regel zum Tode führt über Erstickung. Während PTE die höchste katalytische Aktivität gegenüber paraoxon zeigt, ein sehr wirksames Insektizid, ist es auch in der Lage ¹⁶ eine breite Palette von anderen Pestiziden und V / G – Typ chemischen Nervenmittel zur Hydrolyse. Zur Erleichterung wurde OMV Verpackung, ein bakterielles Plasmid ausgelegt, dass ein Genkonstrukt kodiert, das einen induzierbaren Promotor, einen periplasmatischen Lokalisierungssequenz und eine kurze multiple Klonierungsstelle stromaufwärts von der SC-Gensequenz. Einsetzen des PTE Gens zwischen dem Leiter und SC Sequenz zur Erstellung eines genetischen Schalter erlaubt, die die PTE-SC-Fusionsprotein in den periplasmatischen Raum für OMV Verpackung ausgerichtet ist. Während die hier beschriebenen Bemühungen auf PTE konzentrieren, ist das Enzym-Gen untereinander austauschbar und leicht mit einem anderen Gen-Sequenz ersetzt werden könnte, um facilitate Verpackung eines alternativen Enzym oder Protein.

Was den zweiten Teil des synthetischen Bindung, eine reichliche outer membrane protein (OmpA) wird gewählt, um die ST-Peptidsequenz zu präsentieren. Während die Wahl des Ankerproteins variieren kann, ist es wesentlich, dass das Protein eine permissive Domäne besitzt, die in den periplasmatischen Raum präsentiert, toleriert das Fusionskonstrukt ohne Zytotoxizität zu induzieren, ist bekannt, in OMV anwesend zu sein, und nicht aggregiert, wenn er rekombinant ist hergestellt. OmpA ist ein 37,2 kDa Transmembran – Porin – Protein , das ¹⁷ in der bakteriellen äußeren Membran und anschließende OMV stark exprimiert wird bekannt sein. Es liegt im Transport von kleinen Molekülen verwickelt <2 nm in der Größe, in der Bakterienmembran ^18. Einheimische OmpA hat zwei strukturell unterschiedliche Domains, ein Trans Beta Barrel – Motiv und ein periplasmatisch löslichen C-terminalen Teil bekannt mit dem Peptidoglycan ¹⁹ zu interagieren. In der Mutante OmpA-ST Fusion designed hier der C-terminalen Teil von OmpA wurde gelöscht und die ST wurde dem periplasmatisch zugewandt N- oder C-Terminus fusioniert. Löschen des periplasmatischen Teil OmpA verringert die Anzahl der Wechselwirkungen zwischen der äußeren Membran und der Peptidoglykan in Membrandestabilisierung resultierende was zu hyper-vesiculation ^7. Genomic OmpA wurde zusätzlich zu dem rekombinant exprimierten OmpA-ST-Konstrukt zu mildern Brutto Membrandestabilisierung gehalten.

Protocol

1. Herstellung der Plasmide Bereiten Sie ein Plasmid (zB pET22) mit dem Ankerprotein (OmpA) zu einer biorthogonales Verknüpfung Domäne fusioniert (bezeichnet in diesem Protokoll als Anker-ST), Epitop – Tag (wie 6xHis, myc oder FLAG – Tags für die Reinigung und Identifizierung), periplasmatischen Lokalisation tag, Antibiotikaresistenz, und geeignete Replikationsursprung auf der Basis der ausgewählten Bakterienstamm 7. Extrahieren Plasmid-DNA aus über Nacht Kulturen eines im Ha…

Representative Results

Gleichzeitige Expression von zwei rekombinanten Proteinen, wie für die OMV Verpackungsstrategie in diesem Protokoll detailliert erforderlich ist, kann durch eine Anzahl verschiedener Wege erreicht werden. Hier wird ein Zwei-Vektor-System wurde mit kompatiblen Replikationsursprünge und separaten induzierbaren Genkassetten verwendet. Für die Expression des PTE-SC konstruieren Kommerzielle Plasmidrückgrat (pACY184) konstruiert wurde eine Arabinose induzierbare Gen-Kassette und ein Doppe…

Discussion

Diese Protokoll – Funktionen eine repräsentative gerichtet Verpackungstechnik zu demonstrieren , in dem ein Enzym von Interesse produziert und verpackt in die OMV durch E. coli. Wie bei vielen komplexen Techniken gibt es mehrere Bereiche, in denen das Protokoll zur Verwendung in verschiedenen einzigartigen Anwendungen aufzunehmen modifiziert werden, von denen einige im Folgenden beschrieben. Während der Mechanismus der OMV Verpackung und Enzym Verkapselung kann auf die spezifischen Bedürfnisse angepasst werd…

Materials

IPTG	Any		Always prepare fresh or aliquot and freeze.
L-arabinose	Any		Can be prepared ahead of time and stored at 4C.
Ampicillin	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
Chloramphenicol	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
TB/LB Culture Media	Any		Other growth medias will likely work similarly.
Triton X-100	Any		One of many potential suitable surfactants.
Baffled culture flasks	Any		The baffles promote higher levels of aeration.
CHES	Fisher Bioreagents	BP318-100	Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8).
Paraoxon	Chem Service	N-12816	Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.
Syringe Filter 0.45 µm	Thermo Scientific	60183-221       (30 mm)	Filter diameter will depend on volume of sample.  Low protein binding membrane is critical.
Shaker incubator	New Brunswick	Excella E24	Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.
Sorvall Culture Centrifuge	Thermo Scientific	RC 5B PLUS	Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g.
Sorvall Ultracentrifuge	Thermo Scientific	WX Ultra 90	Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g.
Ultracentrifuge Rotor	Thermo Scientific	AH-629	Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.
Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes        (25 x 89 mm)	Beckman Coulter	344058	Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.
Spectrophotometer	Tecan	Infinite M1000	Necessary for enzyme kinetic assays.
DLS / particle tracking	NanoSight	LM10	Necessary for OMV size distribution and concentration determination.
BL21(DE3)	NEB		Suitable bacterial expression strain.
pET22	EMD Millipore	69744-3	Other plasmids can be used in place of these.
pACYC184	NEB		Other plasmids can be used in place of these.
Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Example kit.