에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장<em> 대장균</em> : 디자인, 생산 및 정제
Summary
A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.
Abstract
외막 소체 (OMV)를 프로그래밍하는 합성 생물학 기술을 적용 점점 관심은 기존의 나노 입자를 합성하기에 너무 어려운 증명 OMV에 대한 몇 가지 매우 흥미로운 독특한 응용 프로그램을 선도하고 있습니다. 지금까지 모든 그람 음성균은 소분자, 펩티드, 단백질, 및 유전 물질을 포함하는화물의 다양한 OMV 시연 용기를 생산하는 것으로 나타났다. 그들의 다양한화물 바탕 OMV 셀 – 셀 통신에서 유전자 전달과 박테리아 OMV를 생성하는 의존 독성 인자의 전달에 이르기까지 여러 생물학적 과정에 연루되어있다. 최근 세균 OMV 제어하고 OMV 재조합 단백질을 직접 포장 기술의 개발을 통해 다양한 애플리케이션에 걸쳐 사용하기 위해 액세스 될 수있다. overa 개선이 프로토콜은 생산, 정제 방법, 및 효소 패키지 OMV 사용 제공 설명재조합 효소 증가 수포 및 향상된 효소의 안정성 게요 생산. 이 프로토콜의 성공적인 이용은 동시에 재조합 단백질을 생산하고, 재조합 단백질과 외막 사이에 앵커 단백질 합성 결합을 통해 생성 OMV 밀봉 용을 지시하는 균주의 생성한다. 제약 약물 전달, 의료 진단 및 환경 개선 :이 프로토콜은 또한 다른 고유 한 애플리케이션에 사용하기 위해이 프로토콜을 채택 할 때 고려해야 할 박테리아 문화뿐만 아니라 적절한 처리 기술과 일에서 OMV를 분리하기위한 방법을 자세히 설명합니다.
Introduction
효소 로딩 박테리아 외막 소체 (OMV)의 설계, 생산 및 정제 방법이 여기에서 제시 하였다. OMV는 30-200 nm의 1, 2에서 크기가 다양 테오 주로 단층, 작은 수 있습니다. 현재까지 연구 된 모든 그람 음성 및 그람 양성 박테리아는 표면 3,4에서 OMV 또는 세포 외 소포 (EV) 중 하나의 릴리스를 증명하고있다. OMV가 생산되고있는 정확한 메커니즘은 아직 완전히 때문에 그들뿐만 아니라 그들이 섬기는 다양한 기능을 분비하는 다양한 세균 집단을 규명해야한다. OMV 복잡한 시그널링 유전자 전위 다양한 서빙 유전 물질 소분자, 펩티드, 단백질로부터화물 다양한 수송 도시되어 있고, 독성은 5,6 기능한다.
OMV의 생물 발생의 정확한 메커니즘은 잘 특징, 세균 종 사이의 차이 표시되지 않습니다. 생에도 불구하고S 사실, 우리는 목적 단백질과 세균의 외막에 매우 풍부한 단백질 내생 이후 OMV 간의 합성 결합을 만들어 OMV으로하는 재조합 단백질의 포장 효율을 향상시키는 방법을 개발했다. 합성 결합 또는 인위적으로 혼입 친화력의 부재에서, 상기 재조합 발현 된 단백질과 OMV 사이 관찰 포장 효율 7 매우 낮다. 이 결과는 잘 이해되지 않은기구에 의해 하나가 박테리아 표면이나 직접 포장 통해 OMV 형성의 정확한 순간에 우연 밀봉 통해 발생 OMV 내 단백질의 혼입으로 예상 할 수있다. 일 다른 사람에 비해 높은 효율로 포장 일부 단백질과 종속 단백질은 매우 약간의 성공이 우연 캡슐화하지만 효과적인 포장에 의존 주변 세포질 공간 내 표현을 통해 단순히 통해 단백질을 포장에서 관찰 된입니다전혀 8-10에서 포장하지 않습니다. 일반적인 합성 생물학 기술을 이용하여, 우리는 대장균 (E. coli에) 동시에 제조, 포장 및화물을위한 박테리아에 의해 선택되는 방법 OMV가 형성되는 방식에 대한 현재의 기술 한계를 회피 OMV에 목적 활성 효소를 분비을 설계하고자 포장.
선택 합성 링크가 OMV 방향으로 포장을 용이하게하도록 본 출원의 목적을 위해 분리 된 단백질 바이오 콘쥬 게이션 시스템을 선택 하였다. 이름이 암시 하듯이 분할 단백질 바이오 콘쥬 게이션 시스템은 서로 상호 보완적인 두 서브 유니트 도메인으로 구성된다. 이 프로토콜의 목적을 위해 선택한 분할 단백질 도메인은 연쇄상 구균 화농의 피브로넥틴 결합 단백질 (FbaB) (11)에서 파생 된 SpyCatcher (SC) 및 SpyTag (ST) 도메인으로하고라고합니다. 이 분할 단백질 시스템은 w에서 이례적인 일이다암탉 개의 서브 유닛이 근접 내에 isopeptide 결합되어 자발적으로 공유 결합을 생성 산과 라이신 아미노산 잔기 아스파르트 기단 사이에 형성한다. Isopeptide 결합 형성은 샤페론 단백질, 효소, 촉매 또는 보조 인자의 첨가를 필요로하지 않고, 용이하게 실내 온도 (RT)에서 생리 학적으로 관련된 조건 (12)의 넓은 범위에 걸쳐 일어날 수있다.
개념의 증거로, Brevundimonas의 diminuta에서 phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1)는 OMV (13) 파생 대장균으로 포장하기 위해 선택되었다. PTE는 이핵 아연 / 아연 활성 부위를 포함하고 dialkylphosphates 및 아릴 알코올 (14)에 aryldialkylphosphates 변환 가수 분해 반응을 통해 유기 인산 화합물을 분해 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 유기 인산 화합물에 노출되면 신경 근육 접합부 보는 건에서 아세틸 콜린 에스 테라 제에 의해 아세틸 콜린의 가수 분해를 억제을 통해 적절한 신경 전달 물질의 기능을 손상15 극도로 위험한 g의 유기 인산 화합물 유래 화합물 등을들 수있다. 장기간 또는 유기 인산 화합물에 상당한 노출은 일반적으로 통제 할 수없는 경련을 초래 일반적으로 질식을 통해 죽음을 발생합니다. PTE가 paraoxon 향해 높은 촉매 활성을 나타내는 반면, 매우 강력한 살충, 또한 다른 살충제 및 V / G 형 화학 신경 제제 (16)의 넓은 범위를 가수 분해 할 수있다. OMV 패키징을 용이하게하기 위해, 박테리아 플라스미드는 유도 성 프로모터하는 주변 세포질 위치 파악 시퀀스 및 SC 유전자 서열 상류 짧은 다중 클로닝 부위를 포함하는 유전자 구조를 인코딩되도록 설계 하였다. OMV 포장에 대한 주변 세포질 공간으로 PTE-SC 융합 단백질을 대상으로하는 유전자 스위치의 생성을 허용하는 지도자와 SC 시퀀스 사이의 PTE 유전자의 삽입. 여기서 설명하는 노력이 PTE에 집중하지만, 효소 유전자가 상호 교환 용이 FAC 다른 유전자 서열로 대체 될 수있다다른 효소 또는 단백질의 ilitate 포장.
합성 링크의 두 번째 부분으로 풍부 외막 단백질 (하는 OmpA)는 ST의 단백질 서열을 제공하도록 선택된다. 변할 수 앵커 단백질의 선택은, 단백질은 원형질막 주위 공간에 표시하는 허용 도메인이 세포 독성을 유발하지 않고 융합 구조를 견뎌 것이 중요하면서 재조합 때, OMV에 존재하는 것으로 알려져 있으며, 응집하지 않는다 생산했다. 높게하는 OmpA 박테리아 외막 이후 OMV (17)에 표시 될 것으로 알려진 37.2 kDa의 포린 횡단 단백질이다. 그것은 작은 분자의 운반에 관여하고, 박테리아 막 (18)을 가로 질러 크기가 2 nm의 <. 네이티브하는 OmpA 두 구조적 고유 도메인, 경막 베타 배럴 모티브 및 펩티도 글리 칸 (19)과 상호 작용하는 것으로 알려진 periplasmically 수용성 C 말단 부분을 가진다. 돌연변이하는 OmpA-ST 융합 고안에서D 여기하는 OmpA의 C 말단 부분은 삭제하고, ST는 periplasmically 직면 N- 또는 C 말단에 융합되었다. 하는 OmpA의 주변 세포질 부분을 삭제하면 외막과 하이퍼 수포 7로 이어지는 막 불안정의 결과로 펩티도 글리 사이의 상호 작용의 수를 감소시킨다. 게놈하는 OmpA은 총 멤브레인 불안정을 완화하는 재조합 발현하는 OmpA-ST 구조 이외에 유지 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
대표적인 방법을 설명하기 위해이 프로토콜 기능은 관심있는 효소를 생산 E. coli에 의해 OMV로 패키징하는 패키징 방법을 지시했다. 많은 복잡한 기술과 같이, 프로토콜은 아래에 설명되는 일부 다른 고유 한 애플리케이션에서 사용하기 위해 수용하도록 변형 될 수있는 복수의 영역이있다. OMV 포장 및 효소 캡슐의 메커니즘은 특정 요구에 적용 할 수있는 반면 성공에 중요한이 프로토콜 내?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was funded by the Office of Naval Research through Core funds provided to the Naval Research Laboratory.
Materials
| IPTG | Any | Always prepare fresh or aliquot and freeze. | |
| L-arabinose | Any | Can be prepared ahead of time and stored at 4C. | |
| Ampicillin | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| Chloramphenicol | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| TB/LB Culture Media | Any | Other growth medias will likely work similarly. | |
| Triton X-100 | Any | One of many potential suitable surfactants. | |
| Baffled culture flasks | Any | The baffles promote higher levels of aeration. | |
| CHES | Fisher Bioreagents | BP318-100 | Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8). |
| Paraoxon | Chem Service | N-12816 | Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly. |
| Syringe Filter 0.45 µm | Thermo Scientific | 60183-221 (30 mm) | Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical. |
| Shaker incubator | New Brunswick | Excella E24 | Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth. |
| Sorvall Culture Centrifuge | Thermo Scientific | RC 5B PLUS | Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g. |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | WX Ultra 90 | Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g. |
| Ultracentrifuge Rotor | Thermo Scientific | AH-629 | Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced. |
| Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced. |
| Spectrophotometer | Tecan | Infinite M1000 | Necessary for enzyme kinetic assays. |
| DLS / particle tracking | NanoSight | LM10 | Necessary for OMV size distribution and concentration determination. |
| BL21(DE3) | NEB | Suitable bacterial expression strain. | |
| pET22 | EMD Millipore | 69744-3 | Other plasmids can be used in place of these. |
| pACYC184 | NEB | Other plasmids can be used in place of these. | |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Example kit. |
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