We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.
Klik kemier er blevet undersøgt til anvendelse i talrige biomaterialer applikationer, herunder drug delivery, tissue engineering, og cellekultur. Især lys-medierede klik reaktioner, såsom photoinitiated thiol-en og thiol-yn-reaktioner, hvilket gav Spatiotemporal kontrol over materialeegenskaber og tillade udformningen af systemer med en høj grad af brugervenlighed rettet ejendom kontrol. Fabrikation og ændring af hydrogel-baserede biomaterialer ved hjælp af præcision ydes af lys og den alsidighed, der tilbydes af disse thiol-X PhotoClick kemier er af stigende interesse, især til dyrkning af celler i veldefinerede, biomimetiske mikromiljøer. Her beskriver vi fremgangsmåder til photoencapsulation af celler og efterfølgende photopatterning af biokemiske signaler inden hydrogelmatricer vha alsidige og modulære byggeklodser polymeriseres ved en thiol-en PhotoClick reaktion. Specifikt er en strategi, der fremlægges for constructing hydrogeler fra allyloxycarbonyl (Alloc) -funktionaliserede peptid tværbindinger og vedhæng peptidgrupper og thiol-funktionaliserede poly (ethylenglycol) (PEG), der hurtigt polymeriserer i nærværelse af lithium acylphosphinate fotoinitiator og cytocompatible doser af langbølget ultraviolet (UV) lys. Overfladiske teknikker til at visualisere photopatterning og kvantificere koncentrationen af peptider der adderes, er beskrevet. Derudover er etablerede metoder til indkapsling celler, specifikt humane mesenkymale stamceller, og bestemmelse af deres levedygtighed og aktivitet. Mens dannelsen og indledende mønsterdannelse af thiol-Alloc hydrogeler Her vises, disse teknikker bredt kan anvendes på en række andre lette og radikal-initierede materiale systemer (f.eks thiol-norbornen, thiol-acrylat) til at generere mønstrede substrater.
Klik kemier anvendes i stigende grad i udformningen af materialer til mange biomedicinske applikationer, herunder drug delivery, tissue engineering, og kontrolleret cellekultur, på grund af deres selektive, effektive, og ofte cytocompatible reaktiviteter. 1-3 PhotoClick kemier, der udnytter lys til at udløse eller indlede reaktioner (f.eks, azid-alkyn, 4 thiol-en, fem og tetrazole-alken 6) er af særlig interesse for dannelsen eller ændring af biomaterialer. Rapid satser under milde betingelser og kontrol over, hvornår og hvor de finder sted med lys gør disse reaktioner velegnede for bruger-rettet styring af biomateriale egenskaber i overværelse af celler. 7,8 Især har thiol-en PhotoClick kemier blevet brugt at generere hydrogel-baserede biomaterialer med robuste mekaniske egenskaber 5,9 og til indkapsling af en lang række celletyper, herunder, men ikket begrænset til, humane mesenkymale stamceller (hMSC'er), fibroblaster, chondrocytter og pancreasceller, med løftet til celledyrkning og levering. 10,11 Yderligere har disse kemier blevet anvendt til den rumlige mønsterdannelse af biokemiske signaler til at efterligne centrale aspekter af native celle mikromiljøer og lette passende celle-matrix-interaktioner, herunder adhæsion, differentiering og invasion. 3,12
Til konstruktion af thiol-en hydrogeler med lys, peptider der indeholder cysteiner (thiol) reageres sædvanligvis med polymerer funktionaliseret med acrylater eller norbornener ( 'en-") for hurtig, photoinitiated polymerisering under cytocompatible betingelser. 13. Udvidelse denne værktøjskasse, vi søgte at etablere metoder til hydrogel formation med nye alsidige og tilgængelige byggesten, der krævede minimal syntetisk forarbejdning eller var kommercielt tilgængelige mod deres brede anvendelse som syntetiske ekstracellulære matricer.14 Konkret blev peptider modificeret med allyloxycarbonyl (Alloc) -beskyttet lysiner: en for vedhæng, integrin-bindende grupper for at fremme celleadhæsion [K (Alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] eller to for ikke-nedbrydelige eller celle-nedbrydeligt tværbindinger [K ( alloc) RGKGRKGK (Alloc) G eller KK (alloc) GGPQGIWGQGK (Alloc) K = Pep2Alloc hhv]. Med disse sekvenser, blev fastsat betingelser for hurtig reaktion (1-5 min) med fire-arm thiol-modificerede poly (ethylenglycol) (PEG4SH) ved anvendelse cytocompatible doser af langbølget UV-lys (10 mW / cm2 ved 365 nm) og fotoinitiatoren lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). De resulterende hydrogeler var stabile under celle dyrkningsbetingelser for uger. At muliggøre celle-drevet nedbrydning og remodellering blev en enzymatisk spaltelig peptid indarbejdet i gelen tværbindinger (dvs. GPQGIWGQ), 15 og en model primær celle, humane mesenkymale stamceller (hMSC'er), forblev stærkt levedygtige efter indkapsling og During kultur i disse matricer. Endvidere er peptider blevet rumligt mønstret inden for disse materialer, og hMSC'er forbliver levedygtige og metabolisk aktive under photopatterning betingelser. Alternative vedhæng peptidsekvenser, som ikke er vist her (f.eks IKVAV, YIGSR, GFOGER, etc.), også kan inkorporeres i matricer til at probe yderligere celle-interaktioner med det omgivende mikromiljø. Disse resultater er lovende for anvendelse af disse hydrogel-baserede materialer til tredimensionel (3D) cellekultur og levering til at studere og direkte celle-matrix-interaktioner for en række forskellige celletyper.
Heri, fremgangsmåder photoencapsulate celler og efterfølgende photopattern biokemiske signaler inden for den foreslåede hydrogelsystem præsenteres (figur 1). Teknikker til at observere og kvantificere disse photopatterns også er påvist: især, i) den kvantitative og kvalitative brug af Ellmans assay til at bestemme ændringer udvition af frie thioler inden mønstrede substrater og ii) den komplementære kvalitative brug af fluorescerende peptider (AF488Pep1Alloc) at observere disse mønstre i tre dimensioner. Endvidere kan assays bestemme levedygtigheden (live / dead levedygtighed / cytotoksicitet farvning) og metabolisk aktivitet (MTS; 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) 2H-tetrazolium) præsenteres, så brugerne kan bestemme cytocompatibility af photoencapsulation og photopatterning betingelser for forskellige cellelinjer inden hydrogel matricer. Mens protokollen påvises en let lysbaseret PhotoClick hydrogelsystem, kan teknikkerne anvendes på talrige andre radikalt initieret hydrogel systemer til photoencapsulation og photopatterning i nærvær af celler.
Proceduren præsenteres her demonstrerer teknikker til at photoencapsulate celler inden hydrogeler dannet ved thiol-en click-kemi-og efterfølgende photopattern gelerne med biokemiske signaler. Anvendelsen af lys til at begynde med danner hydrogeler muliggør homogen blanding og suspendering af cellerne inden før polymerisering polymeropløsningen. Hurtig polymerisation "låser" gelen i form af den definerede mug og rumme suspenderes celler i hydrogel netværket. Geler kan også formes til talrige forskellige former (f.eks objektglas eller en sprøjte tips) afhængigt af den endelige ønskede anvendelse. For eksempel celler indkapslet i 3D kultur i hydrogeler bundet til objektglas er særligt anvendelige til billedbehandlingsapplikationer som lysdæmpning er begrænset inden en tynd prøve. Sprøjte forme kan anvendes til hurtig indkapsling af celler, hvilket tillader et større antal prøver, der skal fremstilles på kort tid (sammenlignet med objektglass), der kan anvendes til eksperimenter, der kræver et stort antal celler, såsom flowcytometri eller qPCR. Efterfølgende disse geler kan derefter mønstret med biokemiske signaler for at fremkalde de ønskede cellulære reaktioner såsom differentiering eller invasion. 30,31
Assays for levedygtighed og metabolisk aktivitet indikerer overlevelse af celler til materialet systemet og mønsterdannende betingelser præsenteret. Bemærk, at metabolisk aktivitet blev overvåget indtil dag 3 i ikke-nedbrydelige geler (RGKGRK peptid krydsbinding) at vurdere de første virkninger af polymerisering og mønsterdannende betingelser på celle funktion. Derudover en membran integritet assay (levende / død levedygtighed / cytotoksicitet farvning) af hMSC'er på 1 og 6 dage efter indkapsling i geler formuleret med et nedbrydeligt peptid krydsbinding (GPQGIWGQ) støtter, at cellerne forbliver levedygtige og spredes på en uge i kultur. Levedygtighed yderligere cellelinier er blevet rapporteret for photopatterning betingelser 32 svarende til dem,anvendes her og kan vurderes for den beskrevne hydrogel-system med anvendelse af levende / døde farvning og metaboliske aktivitetsassays. Mens vi ikke har observeret problemer med cellelevedygtighed ved hjælp af dette materiale, og beslægtede procedurer (4.2 og 4.3), kan nogle celletyper være følsomme over for frie radikaler og / eller lyseksponering. I dette tilfælde kan brugere overveje at bruge ikke-photoinitiated materialer, såsom azid-alkyn, 12 FXIII, 31 eller Diels Alder-baserede hydrogel dannelse kemier. 33
Overfladiske teknikker til at detektere og kvantificere mønster af biokemiske signaler inden geler også præsenteres (3.1 og 3.2). Ellmans assay er af særlig interesse, fordi reagenserne er kommercielt tilgængelige, og der kræves ingen ekstra syntetisk behandlingstrin eller dyrere reagenser (fx fluorescens-mærkede peptid). Ellmans assay kan anvendes til præcist at bestemme ændringen af frie thioler med biokemiske signaler under Forskelnt photopatterning betingelser, samt til hurtigt visualisere mønstre. Til kvantificering peptid inkorporering, thiol funktionelle koncentration gruppe før og efter mønsterdannelse, som et kvantitativt mål for peptid inkorporering, er direkte vurderes med Ellmans assay. Mens denne type kvantificering kan gøres med fluorescensmærkede peptider, 34 imaging-baserede kvantificering kræver flere tidskrævende trin håndtering og analyse (fx syntese af en fluorescens-mærket peptid og generering af en kalibreringskurve at relatere fluorescens til peptidkoncentration anvendelse af billedanalyse). For imaging peptid inkorporering kan Ellman reagens anvendes direkte på prøver og straks visualiseret. Mens begrænset til x- og y-planer for mønster visualisering kan teknikken anvendes som en enkel, rutinemæssig metode til at bestemme, om matricer indeholdende frie thiolgrupper er blevet mønstret. Det er vigtigt at bemærke, at Ellmans assay ikke Considered cytocompatible, så mens det kan anvendes til at observere og kvantificere photopatterns, det kan ikke ske i nærvær af celler. Til billeddannelse af mønsterdannelse i tre dimensioner og i nærvær af celler, konjugeringen af fluorescerende peptider inden hydrogelmatricer fortsat er en stærk og udbredt fremgangsmåde. Opløsning af mønstre kan evalueres i x-, y- og z-planer ved hjælp konfokal mikroskopi, og denne metode er cytocompatible således at der kan identificeres celler inden mønstrede regioner eller ikke-mønstrede regioner. Tilsammen Ellmans assay og billedbehandling teknikker er komplementære redskaber for forskere til at vurdere både kvantitativt og kvalitativt photopatterning af biokemiske signaler inden for materialer systemet.
PhotoClick, eller mere bredt photoinitiated, kemier til dannelse og modifikation af hydrogeler i nærvær af celler er talrige. Støbning, indkapsling, og mønsterdannende teknikker præsenteres her er ikke limgrænset til den beskrevne materiale systemet og kan anvendes til alternative lysbaserede kemier, såsom thiol-alkyn, 35 azid-alkyn, 4 og andre thiol-en kemier (f.eks thiol-norbornen), 10,13 samt med forskellige fotoinitiatorer, såsom Irgacure 2959, Eosin Y, og campherquinon. Bemærk, kan det være nødvendigt at justere proceduren parametre (f.eks, inkubationstider, polymerisationstiderne, celle tæthed) for at sikre, at betingelserne er cytocompatible for disse andre systemer. Da mønsterdannelsesprocessen kræver diffusion af det alloc-modificerede peptid (er) i hydrogelen (2.2.3-2.2.5), kan denne proces være mest brugbar for tilsætning af integrin-bindende dele (f.eks peptider eller ekstracellulære matrix-protein fragmenter) til hydrogelen, hvor binding af liganden til netværket er påkrævet til generering af trækkræfter ved aktivering af cellen og fuld integrin. 36 Note, for biomolekyler, der kanvære tilsvarende aktive i opløsning eller ved immobilisering (fx, vækstfaktorer eller cytokiner), kunne inkubationstrinet til delen diffusion (~ 1 time) i hydrogelen føre til signalering begivenheder, sammenfoldede mønsterdannende resultater. Der er etableret andre fremgangsmåder til vækstfaktor immobilisering eller lokal binding til deres mønsterdannelse. 37-39 Derudover er mønster beslutning dikteret af kontrol over lyseksponering. Her, fotomasker tillader design af mønstre gennem gelen dybde og i x- og y-planer; imidlertid kan der opnås større rumlig kontrol over mønsterdannelse af biokemiske signaler inden geler med alternative bestråling såsom anvendelse af et to-foton konfokalt mikroskop for at generere mønstre i x-, y-, og Z fly. 34,40 Endelig er det vigtigt at bemærke, at mens materialesystemet anvendelse i den pågældende procedure er kun indledningsvis modificeret med biokemiske signaler, kunne ortogonale PhotoClick kemier anvendes til at tillade alterationer i matrix egenskaber over tid. 12 Proceduren og teknikker der præsenteres her tilføje mangfoldighed til de nuværende tilgange til at skabe syntetiske matricer med veldefinerede og spatiotemporally-kontrollerede egenskaber. Især vil den kommercielle tilgængelighed af reagenser og materialer, der anvendes inden for denne procedure være nyttige for en bred vifte af forskere interesseret i at bruge hydrogel-baserede biomaterialer til applikationer i kontrolleret cellekultur.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Delaware Cobre programmer i Drug Discovery og i Advanced Biomaterialer finansieret af institutionsudvikling Awards fra National Institute of Generals Medical Sciences på National Institutes of Health (P20GM104316 og P30 GM110758-01 henholdsvis), den Pew Charitable Trusts (00026178), en National Science Foundation Career Award (DMR-1.253.906), Burroughs Wellcome Fund (1.006.787), og National Science Foundation IGERT SBE2 program på University of Delaware (stipendium til L. Sawicki). Forfatterne takker Delaware Biotechnology Institute Bioimaging Center ved University of Delaware til uddannelse og adgang til konfokal mikroskopi, Ms Katherine Wiley for assistance under videooptagelse, Mr. Matthew Rehmann for generøst giver hMSC'er isoleret fra knoglemarv, Prof. Christopher J . Kloxin og Mr. Stephen Ma for generøst leverer fotomasker, og Prof. Wilfred Chen til anvendelse af den automatiserede pladelæser. </p>
Custom Peptides | Various Vendors | —- | Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep. |
4arm PEG Thiol, MW 20k | JenKem USA | 4ARM-SH | Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced. |
Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Colorado Photopolymer Solutions | Li-TPO | |
Dimethyl Phenylphosphonite | Sigma Aldrich | 149470 | Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
2.4.6-Trimethylbenzoyl Chloride | Sigma Aldrich | 682519 | Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Lithium Bromide | Sigma Aldrich | 213225 | |
2-Butanone | Sigma Aldrich | 360473 | |
Flask, Round Bottom, 100 mL | Chemglass | CG-1506-05 | |
80 mL Filter Funnel, Buchner, Medium Frit | Chemglass | CG-1402-L-02 | Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired. |
Magnetic Stir Bars | Various Vendors | —- | |
Magnetic Stirring and Hot Plate | Various Vendors | —- | |
Vacuum Dessicator | Various Vendors | —- | |
Deuterium Oxide | Acros Organics | 16630 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190-250 | |
Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
Fungizone | ThermoFisher Scientific | 15290-018 | |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Select appropriate medium and trypsin depending on cell type. |
Microcentrifuge tubes | Various Vendors | —- | 1.5 or 2 mL sizes, sterile. |
BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle) | Fisher Scientific | 14-823-16H | Product number listed here is for a 1 mL syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX). |
Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
High-Purity Silicone Rubber, 0.010" Thick, 6" x 8" Sheet, 55A Durometer (Gasket) | McMaster Carr | 87315K62 | |
Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
RainX, Original | Amazon | 800002243 | May be purchased from other vendors. |
Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2 | |
Photomasks | Advance Reproductions Corporation | —- | Photomask Division, different designs may be printed as desired. |
DTNB; Ellman's Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | ThermoFisher Scientific | PI-22582 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E6758 | |
Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS | Fisher Scientific | S318 | |
Orthophosphoric Acid | Alfa Aesar | 33266 | |
Cysteine Hydrochloride Monohydrate | Sigma Aldrich | C7880 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | ThermoFisher Scientific | L-3224 | |
CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay | Promega | G3582 | |
Centrifuge | Various Vendors | —- | Capable of speeds at 90-110 x g. |
Multiwell Plate Reader | Various Vendors | —- | Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate. |
Epifluorescent or Confocal Microscope | Various Vendors | —- | To visualize peptide patterns and cells within hydrogels. |
Omnicure Exfo Series 2000 | Excelitas Technologies | —- | Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels. |
Zeiss Zen Lite Software | Zeiss | —- | Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes |
ImageJ | NIH | —- | Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis |