Summary

Novel de Ligação a RNA Proteínas Isolamento pelo rápido Metodologia

Published: September 30, 2016
doi:

Summary

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Abstract

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

Introduction

Proteínas de ligação a ARN (RBPs) representar cerca de 10% de S. proteínas cerevisiae 1,2 e cerca de 15% de proteínas de mamífero 3-5. Eles estão envolvidos em muitos processos celulares, tais como processamento de mRNA pós-transcricional e regulação, tradução, biogênese do ribossomo, tRNA aminoacila�o e modificação, a remodelação da cromatina, e muito mais. Um subgrupo importante de RBPs é as proteínas de ligação ao ARNm (mRNPs) 6,7. No decurso da maturação do mRNA, diferentes RBPs ligar a transcrição e mediar a transformação nuclear, exportação para fora do núcleo, a localização celular, tradução e degradação 6-8. Assim, o conjunto distinto de RBPs ligados a um transcrito particular, a qualquer ponto de tempo determina o seu processamento e em última análise o seu destino.

A identificação de RBPs associados a um mRNA poderia melhorar significativamente a nossa compreensão dos processos subjacentes à sua regulação pós-transcricional. Diverse genética, Métodos microscópicos, bioquímicos e de bioinformática têm sido utilizados para identificar proteínas envolvidas na regulação do ARNm (revisto em 9-11). No entanto, apenas alguns desses métodos permitem a identificação de proteínas associadas a um ARNm alvo particular. Digno de nota é o sistema híbrido de levedura Três (Y3H), que utiliza o mRNA de interesse como isca para pesquisar uma biblioteca de expressão em células de levedura. Os clones positivos são observados geralmente através de uma selecção de crescimento ou repórter expressão 12-14. A principal vantagem deste método é o grande número de proteínas que podem ser digitalizados num ambiente celular e a capacidade para medir a força da interacção RNA-proteína. Desvantagens incluem o número relativamente grande de resultados falsos positivos devido à ligação não específica, eo alto potencial de resultados falsos negativos devido, em parte, a misfolding da presa proteína de fusão ou o RNA isca.

Uma alternativa à abordagem genética é purifi afinidadecatião de ARN com as suas proteínas associadas. Poli A contendo ARNm pode ser isolado através da utilização de colunas de oligo dT, e as suas proteínas associadas são detectados por espectrometria de massa. A interacção RNA-proteína é conservado no seu contexto celular por reticulação, o que faz com que as ligações covalentes de curto alcance. A utilização da coluna de oligo dT proporciona uma visão global de todo o proteoma que está associado com qualquer poli A de mRNA contendo 3,5,15. No entanto, este não fornece uma lista de proteínas que estão associadas com um ARNm específico. Muito poucos métodos estão disponíveis para realizar uma tal identificação. O método implica a transfecção PAR de ácido nucleico com complementaridade com o mRNA alvo 16,17. O ácido nucleico está também ligado a um péptido, o que permite a reticulação de RBPs em estreita proximidade ao local de interacção. Após a reticulação, o ácido nucleico RBP-péptido pode ser isolado e submetido a análise proteómica. Recentemente, uma metodologia baseada na aptâmero eraaplicado com sucesso a extractos de linhas de células de mamíferos 18. Um aptâmero de ARN com afinidade melhorada para estreptavidina e foi desenvolvido fundido com uma sequência de interesse (elemento ricos em AU (ARE), neste caso). O ARN aptâmero-ARE foi ligado a esferas de estreptavidina e misturados com o lisado celular. As proteínas associadas a que a sequência são foram purificados e identificados por espectrometria de massa (MS). Embora este método detectado associações que ocorrem fora das definições celulares (isto é, in vitro), é susceptível de ser modificado no futuro, de modo a introduzir os aptâmeros no genoma e, assim, permitir o isolamento de proteínas associadas com o ARNm enquanto que na meio celular (isto é, in vivo). Em leveduras, onde manipulações genéticas estão bem estabelecidos, o método rápido (desenvolvido no laboratório do Prof. Jeff Gerst) fornece uma visão in vivo associações 19. Rápida combina o específico e forte ligação da proteína de revestimento de MS2 (MS2-CP) para a sequência de ARN MS2, e do domínio de ligação a estreptavidina (SBP) a estreptavidina esferas conjugadas. Isso permite a purificação eficiente de mRNAs MS2-marcadas através de contas de estreptavidina. Além disso, a expressão de 12 cópias de MS2 laços permite até seis MS2-CPS de se ligar simultaneamente para o RNA e aumentar a eficiência do seu isolamento. Este protocolo foi, portanto, sugerida para permitir a identificação de novas proteínas associadas à ARNm uma vez que as amostras eluídas são sujeitas a análise por espectrometria de massa proteómica.

Recentemente, utilizou rápido para identificar novas proteínas associadas com a levedura Pmp1 ARNm 20. Pmp1 ARNm foi anteriormente mostrado para ser associado com a membrana do RE e do seu 3 'não traduzida (UTR) foi encontrado para ser um dos principais determinantes nesta associação 21. Assim, RBPs que se ligam Pmp1 UTR 3 'são susceptíveis de desempenhar um papel importante na sua localização. Rápida seguida de cromatografia líquiday-espectrometria de massa / espectrometria de massa (LC-MS / MS) resultou na identificação de várias novas proteínas que interagem com Pmp1 20. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado da metodologia rápida, controles importantes que precisam ser feitas, e dicas técnicas que podem melhorar o rendimento e especificidade.

Protocol

Nota: Inserir uma sequência que consiste em 12 locais de ligação MS2 (MS2 malhas; MS2L) no locus genómico desejado, geralmente entre a grelha de leitura aberta (ORF) e a 3 'UTR. Um protocolo detalhado para essa integração é fornecido em outros lugares 22. Verifique a inserção correta e expressão por PCR, análise de Northern ou RT-PCR 20,23. É importante verificar que a integração não interferiu com a síntese do 3 'UTR. Além disso, um plasmídeo que expressa MS2 CP-fundido c…

Representative Results

RAPID permite o isolamento de um ARN alvo específico com as suas proteínas associadas. Crítico para o seu sucesso é manter o ARN intacto, tanto quanto possível, obtendo-se assim uma quantidade suficiente de proteínas. Para determinar a eficiência e a qualidade de isolamento de ARN, análise de Northern é realizado (Figura 1A). análise do Norte tem a vantagem de reportar diretamente a eficiência e qualidade dos rápidos. Assim, as quantidades relativas dos produ…

Discussion

Vários métodos utilizam o isolamento de ARNm específicos para identificar as suas proteínas associadas 11,34 35. Estes métodos aplicam-se in vitro e in vivo em estratégias para investigar interacções ARN-proteína. Métodos in vitro incubar exogenamente ARN transcrito com lisado celular para capturar RBPs e isolar complexos de RNP 36,37. Uma abordagem eficaz deste tipo foi apresentado recentemente, o que permitiu a identificação de novas proteínas qu…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Prof. Jeff Gerst e Boris Slobodin para os seus conselhos úteis na criação do protocolo rápida e fornecendo os plasmídeos necessários. Agradecemos também a Dr. Abigail Atir-Lande por sua ajuda no estabelecimento deste protocolo e Dr. Tamar Ziv do Smoler Proteomics Center for sua ajuda com a análise LC-MS / MS. Agradecemos Prof. TG Kinzy (Rutgers) para o anticorpo YEF3. Este trabalho foi apoiado pela concessão 2011013 do Binacional Science Foundation.

Materials

Tris sigma T1503
SDS bio-lab 1981232300
DTT sigma D9779
Acidic Phenol (pH 4.3) sigma P4682
Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) sigma P1944
Chloroform bio-lab 3080521
Formaldehyde Frutarom 5551820
Glycine sigma G7126
NP-40 Calbiochem 492016
Heparin Sigma H3393
Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) Sigma P7626
Leupeptin Sigma L2884
Aprotinin Sigma A1153
Soybean Trypsin Inhibitor Sigma T9003
Pepstatin Sigma P5318
DNase I Promega M610A
Ribonuclease  Inhibitor Takara 2313A
Glass Beads Sartorius BBI-8541701 0.4-0.6mm diameter 
Mini BeadBeater BioSpec Mini BeadBeater 16
Guanidinium Sigma G4505
Avidin Sigma A9275
Streptavidin Beads GE Healthcare  17-5113-01
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7906
Yeast tRNA Sigma R8508
Biotin Sigma B4501
Yeast extract Bacto 288620
peptone Bacto 211677
Glucose Sigma G8270
1 x Phosphate-Buffered saline (PBS)
0.2 M NaOH
4 x Laemmli Sample Buffer (LSB) 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.
Hot phenol lysis buffer 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS 
3 M Sodium Acetate pH 5.2
100% and 70% Ethanol (EtOH)
RNase-free water
RaPID lysis buffer 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease  Inhibitor.
2x Cross-linking reversal buffer 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.
RaPID wash buffer 20 mM Tris-HCl pH 7.5,  300 mM NaCl, 0.5% NP-40
0.5 M EDTA pH 8
Silver Stain Plus Kit Bio-Rad  161-0449 For detecting proteins in polyacrylamide gels
SD selective medium  1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine
Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) 1:5,000
Anti GFP antibody Santa Cruz sc-8334 1:3,000
Anti rabbit IgG-HRP conjugated SIGMA A9169 1:10,000

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Citar este artigo
Samra, N., Arava, Y. Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology. J. Vis. Exp. (115), e54467, doi:10.3791/54467 (2016).

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