Novel RNA-bindende proteiner Isolering af den hurtige metode

Summary

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Abstract

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

Introduction

RNA-bindende proteiner (RBP'er) udgør omkring 10% af S. cerevisiae-proteiner ^1,2 og ca. 15% af pattedyrproteiner ^3-5. De er impliceret i mange cellulære processer såsom mRNA post-transkriptionel bearbejdning og regulering, oversættelse, ribosom biogenese, tRNA aminoacylering og modifikation, kromatin remodeling, og mere. En vigtig undergruppe af RBP'er er mRNA-bindende proteiner (mRNPs) ^6,7. I løbet af mRNA modning, forskellige RBP'er binder udskrift og mægle sit nukleare forarbejdning, eksport ud af kernen, cellulære lokalisering, oversættelse og nedbrydning ^6-8. Således distinkt sæt af RBP'er bundet til en bestemt transkript på noget tidspunkt bestemmer dets forarbejdning og i sidste ende dens skæbne.

Identifikationen af ​​RBP'er forbundet med en mRNA i væsentlig grad kan forbedre vores forståelse af processer bag deres post-transkriptionel regulering. forskellige genetiske, Mikroskopiske, biokemiske og bioinformatik metoder er blevet anvendt til at identificere proteiner involveret i mRNA regulering (gennemgået i ^9-11). Men kun nogle få af disse metoder muliggør identifikation af proteiner associeret med en bestemt mål-mRNA. At bemærke er den Gær Tre hybridsystem (Y3H), som anvender mRNA'et af interesse som lokkemad til screening et ekspressionsbibliotek i gærceller. Positive kloner sædvanligvis iagttages gennem en vækst markering eller reporterekspression ^12-14. Den vigtigste fordel ved denne fremgangsmåde er det store antal proteiner, der kan scannes i et cellulært miljø og evnen til at måle styrken af ​​RNA-protein-interaktion. Ulemper omfatter det forholdsvis store antal af falsk positive resultater som følge af ikke-specifik binding, og det store potentiale for falske negative resultater, fordi, delvis kommer misfoldning af fusionsproteinet bytte eller lokkemaden RNA.

Et alternativ til den genetiske fremgangsmåde er affinitet purifierkation af RNA med associerede proteiner. Poly A-holdig mRNA'er kan isoleres ved anvendelse af oligo-dT søjler, og deres associerede proteiner detekteres ved massespektrometri. RNA-protein-interaktion er konserveret i dets cellulære kontekst ved tværbinding, hvilket gør kortrækkende kovalente bindinger. Anvendelsen af oligo dT-søjle giver et samlet overblik over hele proteom som er forbundet med nogen poly A-holdige mRNA ^3,5,15. Det betyder dog ikke give en liste over proteiner, som er associeret med en særlig mRNA. Meget få metoder til rådighed til at udføre en sådan identifikation. Den PAIR metode indebærer transfektion af nukleinsyre med komplementaritet til mål-mRNA ^16,17. Nukleinsyren er ligeledes forbundet med et peptid, der tillader tværbinding til RBP'er i tæt nærhed til samspillet site. Efter tværbinding kan RBP-peptid-nukleinsyre isoleres og underkastes proteomics analyse. For nylig, en aptamer-metode varudmærket anvendes på ekstrakter fra pattedyr cellelinier ^18. Et RNA aptamer med forbedret affinitet til streptavidin blev udviklet og fusioneret til en sekvens af interesse (AU-rige elementer (ARE) i dette tilfælde). Den aptamer-ARE RNA blev bundet til streptavidin-perler og blandet med cellelysat. Proteiner, der er forbundet med ARE-sekvensen blev oprenset og identificeret ved massespektrometri (MS). Selv om denne metode har registreret associationer, der opstår uden for de cellulære indstillinger (dvs. in vitro), er det sandsynligt at blive ændret i fremtiden for at introducere de aptamerer i genomet og således muliggøre isoleringen af proteiner associeret med mRNA'et, mens i cellulære milieu (dvs. in vivo). I gær hvor genetiske manipulationer er veletablerede, den hurtige metode (udviklet i Prof. Jeff Gerst laboratorium) giver et billede af in vivo foreninger ^19. Rapid kombinerer den specifikke og stærke binding af MS2-kappeprotein (MS2-CP) til MS2-RNA-sekvensen, og streptavidin-bindende domæne (SBP) til streptavidin konjugerede perler. Dette muliggør effektiv oprensning af MS2-mærkede mRNA'er gennem streptavidinkugler. Desuden udtryk for 12 eksemplarer af MS2 sløjfer tillader op til seks MS2-CP'er at binde samtidigt til RNA og øge effektiviteten af ​​sin isolation. Protokollen blev derfor foreslået at muliggøre identifikation af hidtil ukendte mRNA-associerede proteiner, når de eluerede prøverne underkastes proteomics analyse ved massespektrometri.

Vi har for nylig udnyttet RAPID at identificere hidtil ukendte proteiner der er forbundet med gær PMP1 mRNA ^20. PMP1 mRNA blev tidligere vist at være associeret med ER-membranen og dens 3'-utranslaterede område (UTR) viste sig at være en afgørende determinant i denne forening ^21. Således RBP'er der binder PMP1 3'UTR sandsynligvis spille en vigtig rolle i dens lokalisering. Rapid efterfulgt af væskekromatografy-massespektrometri / massespektrometri (LC-MS / MS) resulterede i identifikationen af mange nye proteiner, der interagerer med PMP1 ^20. Heri, vi giver en detaljeret protokol af de hurtige metode til vigtige kontroller, der har brug gøres, og tekniske tips, der kan forbedre udbyttet og specificitet.

Protocol

Bemærk: Indsæt en sekvens bestående af 12 MS2-bindingssteder (MS2 sløjfer; MS2L) til den ønskede genomiske locus, sædvanligvis mellem den åbne læseramme (ORF) og 3'UTR. En detaljeret protokol for denne integration tilbydes andre steder 22. Kontroller korrekt isætning og udtryk ved PCR, northern analyse eller RT-PCR 20,23. Det er vigtigt at kontrollere, at integrationen ikke greb ind med syntesen af ​​3'UTR. Desuden bør et plasmid-udtrykkende MS2-CP fusioneret til SBP under eks…

Representative Results

Rapid muliggør isolering af en specifik mål-RNA med dens associerede proteiner. Kritisk for dens succes er at holde RNA intakt så meget som muligt, hvorved der opnås en tilstrækkelig mængde af proteiner. For at bestemme isolation effektiviteten og kvaliteten af RNA, er northern analyse udført (figur 1A). Northern analyse har den fordel, refererer direkte effektiviteten og kvaliteten af ​​hurtige. Således kan de relative mængder af fuld længde og nedbrydning…

Discussion

Forskellige metoder bruger isolering af specifikke mRNA for at identificere deres associerede proteiner ^{11,34 35.} Disse metoder anvendes in vitro og in vivo strategier til at probe RNA-protein interaktioner. In vitro metoder inkuber eksogent transkriberet RNA med cellelysat at indfange RBP'er og isolere RNP komplekser ^36,37. En effektiv tilgang af denne type blev præsenteret for nylig, som gjorde det muligt at identificere nye proteiner, der binder en regu…

Materials

Tris	sigma	T1503
SDS	bio-lab	1981232300
DTT	sigma	D9779
Acidic Phenol (pH 4.3)	sigma	P4682
Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3)	sigma	P1944
Chloroform	bio-lab	3080521
Formaldehyde	Frutarom	5551820
Glycine	sigma	G7126
NP-40	Calbiochem	492016
Heparin	Sigma	H3393
Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF)	Sigma	P7626
Leupeptin	Sigma	L2884
Aprotinin	Sigma	A1153
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T9003
Pepstatin	Sigma	P5318
DNase I	Promega	M610A
Ribonuclease  Inhibitor	Takara	2313A
Glass Beads	Sartorius	BBI-8541701	0.4-0.6mm diameter
Mini BeadBeater	BioSpec	Mini BeadBeater 16
Guanidinium	Sigma	G4505
Avidin	Sigma	A9275
Streptavidin Beads	GE Healthcare	17-5113-01
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906
Yeast tRNA	Sigma	R8508
Biotin	Sigma	B4501
Yeast extract	Bacto	288620
peptone	Bacto	211677
Glucose	Sigma	G8270
1 x Phosphate-Buffered saline (PBS)
0.2 M NaOH
4 x Laemmli Sample Buffer (LSB)			0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.
Hot phenol lysis buffer			10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS
3 M Sodium Acetate pH 5.2
100% and 70% Ethanol (EtOH)
RNase-free water
RaPID lysis buffer			20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease  Inhibitor.
2x Cross-linking reversal buffer			100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.
RaPID wash buffer			20 mM Tris-HCl pH 7.5,  300 mM NaCl, 0.5% NP-40
0.5 M EDTA pH 8
Silver Stain Plus Kit	Bio-Rad	161-0449	For detecting proteins in polyacrylamide gels
SD selective medium			1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine
Anti-eEF3 (EF3A,YEF3)	Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School)		1:5,000
Anti GFP antibody	Santa Cruz	sc-8334	1:3,000
Anti rabbit IgG-HRP conjugated	SIGMA	A9169	1:10,000