Isolering av high-density lipoproteiner for Non-koding små RNA Kvantifisering
Summary
This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.
Abstract
Mangfoldet av små ikke-kodende RNA (Srna) er raskt voksende og deres roller i biologiske prosesser, herunder genregulering, dukker opp. Mest interessant er sRNAs også funnet utenfor cellene og er stabilt til stede i alle biologiske væsker. Som sådan, ekstracellulære sRNAs representerer en ny klasse av sykdoms biomarkører og er sannsynligvis involvert i cellesignalisering og interkommunikasjonsnettverk. For å vurdere deres potensielle biomarkører som kan sRNAs kvantifiseres i plasma, urin og andre fluider. Likevel, for å fullt ut forstå virkningen av ekstracellulære sRNAs som endokrine signaler, er det viktig å finne ut hvilke bærere er transportere og beskytte dem i biologiske væsker (for eksempel plasma) som celler og vev bidra til ekstracellulære Srna bassenger, og celler og vev som er i stand akseptere og utnytte ekstracellulære Srna. For å oppnå disse målene, er det avgjørende å isolere svært rene bestander av ekstracellulære bærerefor Srna profilering og kvantifisering. Vi har tidligere vist at lipoproteiner, spesielt high-density lipoproteiner (HDL), transportere funksjonelle microRNAs (miRNA) mellom celler og HDL-mirnas er betydelig endret i sykdom. Her har vi detalj en ny protokoll som benytter tandem HDL isolasjon med tetthetsultrasentrifugering (DGUC) og fast-protein-væskekromatografi (FPLC) for å oppnå svært ren HDL for nedstrøms profilering og kvantifisering av alle sRNAs, inkludert mirnas, ved hjelp av både høy -throughput sekvensering og real-time PCR tilnærminger. Denne protokollen vil være en verdifull ressurs for etterforskningen av sRNAs på HDL.
Introduction
Ekstracellulære ikke-kodende små RNA (sRNAs) representerer en ny klasse av sykdoms biomarkører og potensielle terapeutiske mål og sannsynligvis legge til rette for celle-til-celle-kommunikasjon 1. Den mest studerte type Srna er microRNAs (miRNA) som er omtrent 22 nts i lengde og er bearbeidet fra lengre forløper-former og primær transkripsjoner 2. mirnas har blitt demonstrert til post-transcriptionally regulere genekspresjon gjennom undertrykkelse av protein oversettelse og induksjon av mRNA degradering to. Likevel mirnas er bare ett av mange typer sRNAs; som sRNAs kan spaltes fra foreldre tRNAs (tRNA-avledet sRNAs, TDR), små kjernefysiske RNA (Srna-avledet sRNAs, sndRNA), små nukleolære RNA (snoRNA-avledet sRNAs, snRNA), ribosomale RNA (rRNA-avledet sRNAs, RDR ), Y RNA (yDR), og andre diverse RNA 1. Noen få eksempler på disse nye sRNAs har blitt rapportert å fungere som ligner på mirnas; imidlertid den biologiske functions av mange av disse sRNAs gjenstår å fastslå, selv om roller i genregulering er sannsynlig 3-6. Mest interessant, mirnas og andre sRNAs er stabilt til stede i ekstracellulære væsker, inkludert spytt, plasma, urin og galle. Ekstracellulære sRNAs sannsynligvis beskyttet mot RNases gjennom sin tilknytning til ekstracellulære vesikler (EV), lipoproteiner, og / eller ekstracellulære ribonucleoprotein komplekser.
Tidligere rapporterte vi at lipoproteiner, nemlig high-density lipoproteiner (HDL), transport mirnas i plasma 7. I denne studien ble HDL isolert ved anvendelse av en sekvensiell fremgangsmåte for densitet-gradient-ultrasentrifugering (DGUC), hurtig protein væskekromatografi (størrelse-eksklusjonskromatografi gelfiltrering, FPLC), og affinitetskromatografi (anti-apolipoprotein AI (apoA-I) immunpresipitasjon ) 7. Bruk begge real-time PCR-baserte low-density arrays og individuelle miRNA analyser, ble miRNA nivåer kvantifisert på HDL isolert fra helbrededin og hyperkolesterolemi fag 7. Ved hjelp av denne tilnærmingen, var vi i stand til å profilere mirnas og kvantifisere spesifikke mirnas i høyrene HDL forberedelser. Siden 2011 har vi fastslått at selv om affinitetskromatografi øker HDL renhet, antistoff metning i stor grad begrenser utbyttet, og kan være kostnads uoverkommelige. For tiden er vår protokoll anbefaler en to-trinns sekvensiell tandem fremgangsmåte for DGUC etterfulgt av FPLC, som også gir høy kvalitet og HDL-prøver for nedstrøms RNA isolering og kvantifisering Srna. På grunn av nylige fremskritt i high-throughput sekvensering av sRNAs (sRNAseq), for eksempel, mirnas, og økt bevissthet om andre ikke-miRNA Srna klasser, er sRNAseq dagens state-of-the-art i miRNA og Srna profilering. Som sådan, anbefaler vår protokoll kvantifisere mirnas og andre sRNAs på HDL prøver ved hjelp sRNAseq. Likevel kan total RNA isolert fra HDL også brukes til å kvantifisere individuelle mirnas og andre sRNAs eller validere sRNAseq resultater ved hjelp av real-time PCR enpproaches. Her beskriver vi i detalj en protokoll for oppsamling, rensing, kvantifisering, dataanalyse, og validering av høyrent HDL-sRNAs.
Det overordnede målet med denne artikkelen er å demonstrere gjennomførbarheten og prosessen med Srna kvantifisering i svært ren HDL isolert fra humant plasma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen er utviklet for å kvantifisere mirnas og andre sRNAs ved high-throughput sekvensering eller real-time PCR på høyrent HDL. Som med en hvilken som helst måte, må spesielle hensyn tas hensyn til hvert trinn i prosessen med rensing av HDL og RNA og deretter kvantifisere sRNAs. Denne protokollen er utformet for prosjekter som starter med ≥ 2 ml plasma. Likevel kan høykvalitets RNA analyser hell være ferdig med HDL renset fra så lite som 80 mL av human eller mus plasma ved hjelp av affinitetskromat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.
Materials
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3X FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
Referências
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
- Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA–novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
- Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
- Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).
- Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
- Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164 (2015).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
- Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
- Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
- Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
- McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145 (2011).
- Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360 (2008).
- Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
- Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
- Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).
