视觉趋化实验是为了更好地了解如何真核细胞趋化控制介导的定向细胞迁移是必不可少的。在这里,我们描述了详细的方法:1)实时,多趋化实验的高分辨率监测,和2)同时可视化趋化梯度和信号中的中性粒细胞样HL60细胞事件的时空动力学。
Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.
真核细胞中感测和朝向趋化梯度内浓度较高移动,蜂窝式过程被称为趋化。趋化起着许多生理过程的关键角色,例如胚胎发生1,神经元图案2,癌细胞3的转移,嗜中性粒细胞向炎症4的部位的募集,并且模型生物体粘菌 5的发展。在一般情况下,真核细胞检测用G蛋白偶联受体5的化学引诱物。化学引诱物与这些受体的接合促进了异源的G蛋白Gα和Gβγ,进而活化下游信号转导途径,最终调节肌动蛋白细胞骨架的时空组织以驱动细胞迁移5-9的离解。
细胞生物学家一直致力于开发和趋化改进是测定以检查G蛋白偶联受体(GPCR)介导的信号如何定向细胞迁移。 Boyden小室或透孔迁移实验是由10博伊登于1960年开发的。该测定法的工作原理是创建趋化化合物的由微孔膜分开的两个井之间的梯度。其简单和易用性,使其成为使用最广泛的趋化性试验日期。然而,该测定不能使细胞的迁移过程中被可视化。该Zigmond室是第一款可视微流体装置,可用于在朝着源趋化11穿越狭窄的收缩盖玻片细胞迁移的清晰成像。邓恩12和英索尔13改性,提高了高分辨率和长期成像能力的Zigmond室趋化性试验的。因为流体流动的高度可预测,扩散显性特性的,微流体已经提供下一generati解关于趋化实验如EZ-TAXIScan(小区迁移率分析装置)。
与保证了梯度的稳定,设备允许6趋化实验,以进行同时( 图1A)。相反在上述各个室测定法产生的定向固定梯度,由冈瑟Gerisch开发的针或微量测定法产生具有可动源14的梯度。在测定中,趋化是从可动微量释放,以产生一个稳定的梯度。有了这个针法,研究人员发现,不同细胞生成具有根本的不同特点伪足。应用荧光显微镜,我们能够以可视化的梯度,以方便在整个15的定量测量。在这项研究中,我们描述了准备HL60趋化(人早幼粒白血病细胞),具体方法同时监控多个趋ASSAYS与细胞迁移分析装置,和可视化信号分子的GPCR介导的时空动力学如蛋白激酶D1在单个活细胞中响应于可见光,spatiotemporally可控趋化刺激。我们的先进的成像方法能够应用于一般的趋化研究,并且特别适用于哺乳动物细胞系统。
在本研究中,我们表明趋化实验的两个例子:首先,由小区迁移分析装置的多个趋化实验的同时监测;第二,趋化梯度的可视化和信令在实时同一细胞事件的时空动力学。
多个同时趋化实验小区的流动性分析装置
在本研究中,我们引入了一个详细的协议来执行使用细胞移动分析装置同时进行多个趋化实验。该设备允许用户观察与传统明场观察的10倍物镜细胞趋化行为。因为流体流的扩散显性特性的,细胞迁移分析装置产生高度可预测的,稳定的梯度,并允许多达六个趋化实验可以同时进行。该协议的关键步骤获得可靠的梯度和对齐单元格的露台线路。用户应严格按照制造商的趋化因子和细胞的固定组件与注入指令。详细说明也可在网上。相比其它趋化方法11-13,15,该装置显著改善趋化实验的可靠性和效率。在尺寸四种尺寸的细胞迁移分析装置的芯片的4,5,6,和8微米的,可容纳不同类型和细胞的尺寸。我们发现,一个4或5微米的细胞迁移分析装置的芯片是适合的HL60和D菌细胞,这是在直径约10-15微米。然而,一个限制是,这个装置不适合于所有类型的细胞。我们不得不使用与Raw267.4细胞中的细胞运动分析装置趋化性试验中收效甚微。其原因可能是Raw267.4细胞迁移速度太慢。高效枝所需要的时间Raw267.4细胞motaxis可能比的梯度由设备维护的时间长得多。相反,转孔迁移实验工作的很好Raw267.4细胞9。另一个限制是荧光观察是不可能与当前设备。未来的方向是监测荧光成像具有较高的放大倍率。这是可能的改进的细胞迁移分析装置,其配备有荧光检测和100X物镜。此外,同步检测次数也提高到12所有这些改进促进趋化实验的增强吞吐量和亚细胞动力学中迁移细胞的观察。
HL60细胞的转染效率高,表达荧光蛋白标记的蛋白质
HL60细胞是一个活跃分裂细胞白血病细胞系,并在悬浮液中生长。据此前报道18-20,HL60细胞至g耐烯转移。既脂质和电穿孔基因转移已经过测试,并与电穿孔,获得更高的转染效率,如在第4节中详细描述的获得高生存能力电穿孔后为由于从电穿孔产生的严重损害获得高转染效率的关键。随后,彻底和温和的细胞处理是必要的,尤其是电后。所有媒体都必须预热并轻轻加入到细胞中电穿孔后的任何步骤。它也是至关重要的细胞的电穿孔试剂的暴露时间最小化。以避免细胞死亡,在电穿孔后,RPMI 1640电恢复介质必须立即向细胞中加入。我们发现,在回收培养基20%胎牛血清,使其比10%FBS的高得多的细胞回收率。电后,在孵化RPMI 1640电恢复中30分钟,是更大的活力和转染的关键效率。为了进一步增加转染效率,我们也使用每转4微克质粒DNA,这是由制造商推荐的质粒的几乎两倍量。
上有电穿孔转染两个主要限制:蛋白表达的顷刻和细胞数的限制(每个转染2×10 6个细胞)。在未分化的细胞,表达仅在第一耦合的细胞分裂是可检测的,因为载体质粒是通过半每次细胞分裂后稀释。为分化的HL60细胞存活不超过48小时。其结果是,任何实验需要新鲜转染实验前6小时。对于一个电穿孔的细胞数仅仅满足为任何生物化学测定的最低要求。对于重复使用或大量的目的,强烈建议在未分化的HL60细胞系建立稳定表达的兴趣WHI的蛋白质通道已经被病毒载体具有标记的荧光蛋白质中,如果病毒载体是可用的,或可以构造。
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the intramural fund of NIAID, NIH.
RPMI 1640 Medium GlutaMAX | Life technologies | 61870-036 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scietific | 11360-070 | |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
1M HEPES sterile solution, pH7.3 | Quality Biological Inc. | A611-J848-06 | |
Penicillin streptomycin solution | Fisher Scientific | 15140122 | |
NucleofectorTM 2b | Lonza | AAB-1001 | |
AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettes | Lonza | VCA-1003 | |
Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
2 % Gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution) | Life technologies | 14025-076 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3803 | |
Single well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155361 | |
Four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
Alexa 594 | Thermo Fisher Scientific | A-10438 | |
fMLP | Sigma -Aldrich | F3506-5MG | |
Cover glass thickness 2 22 x 22 mm | Corning | 2855-22 | |
EZ-TAXIScan | Effector Cell Institute, Inc. | MIC-1001 | |
EZ-TAXIScan chip (5 mm) | Effector Cell Institute, Inc. | EZT-F01-5 | |
1701RN 10ul syringe | Hamilton | 80030 | |
Femtotips II Injection tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | |
TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids. | Eppendorf | 5188900056 | |
DIAS software | Solltech Inc. | ||
LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | Carl Zeiss |