카메라 화학 주성 분석 화학 주성은 매개 세포 이동 방향을 제어하는 방법에 진핵 세포의 이해에 필수적이다. 1) 실시간 다중 화학 주성 분석법 고해상도 모니터링 및 2)에 동시에 화학 유인 그라데이션 시각화 및 호중구와 같은 HL60 세포의 이벤트 신호의 시공간 역학 : 여기서는 대한 구체적인 방법을 설명한다.
Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.
진핵 세포 감각 및 화학 유인 구배 내의 고농도 측으로 이동 셀룰러 과정은 화성이라한다. 화성은 배아 발생 하나, 신경 패터닝이 암세포 (3)의 전이, 염증 (4)의 부위에 호중구 모집하고, 모델 생물 Dictyostelium의 discoideum 5 개발 많은 생리 학적 과정에 중요한 역할을한다. 일반적으로, 진핵 세포는 G 단백질 결합 수용체 (5)를 이용하여 화학 유인 물질을 감지. 이 수용체와 화학 유인 물질의 결합은 결국 궁극적으로 세포 이동 5-9를 구동 할 수있는 액틴 세포 골격의 시공간 조직을 조절하는 다운 스트림 신호 전달 경로를 활성화 이종삼 G 단백질 Gα 및 Gβγ의 분해를 촉진한다.
세포 생물 학자 개발 및 chemotax을 개선 한분석이 G 단백질 결합 수용체 (GPCR) 신호에서 중재가 세포 이동을 지시하는 방법을 검토하는 것입니다. 보이든 챔버 또는 트랜스 웰 마이그레이션 분석은 보이든 (10)에 의해 1960 년에 개발되었다. 상기 분석은 미세 다공성 막에 의해 분리되는 두 개의 웰 사이의 화학 유인 물질 화합물의 구배를 생성하여 작동한다. 단순성 및 사용의 용이성은 현재까지 가장 널리 사용되는 화성 분석 만든다. 그러나, 세포의 마이그레이션 프로세스를 사용하지 않고 분석이 가시화 될 수있다. Zigmond 챔버는 소스 화학 유인 물질 (11)을 향해 좁은 수축 걸쳐 커버 슬립에 대한 세포 이동의 명확한 영상을 허용하는 제 시각 미세 유동 장치이다. 던 12 Insall 13 변형 및 Zigmond 챔버 화성 분석의 고해상도 장기 이미징 성능을 개선 하였다. 때문에 유체 흐름의 높은 예측 확산 지배적 인 특성, 미세 유체는 다음-generati에 대한 솔루션을 제공하고있다이러한 EZ-TAXIScan (세포 이동 분석 장치) 등의 화학 주성 분석에서.
확보 그래디언트의 안정성, 장치는 여섯 화성 분석법 동시에 (도 1A)을 수행 할 수있다. 상기 다양한 챔버 분석에서 생성 된 고정 된 방향성 구배 달리의 Guenther Gerisch 의해 개발 바늘 또는 마이크로 피펫 분석은 가동 소스 (14)와 그라데이션을 생성한다. 상기 분석에서, 화학 유인 물질은 안정한 구배를 생성하도록 가동 마이크로 피펫으로부터 방출된다. 이 바늘 분석을 통해 연구자들은 다른 세포는 근본적으로 다른 특성을 가진 pseudopods를 생성하는 것으로 나타났습니다. 형광 현미경을 적용, 우리는 (15)에 걸쳐 정량적 측정을 용이하게하기 위해 경사를 시각화 할 수 있었다. 본 연구에서는 동시에 여러 화성 ASSA을 모니터링 화성 HL60 (인간 전 골수성 백혈병) 세포를 제조하는 자세한 방법을 설명세포 이동 분석 장치 및 표시, 예컨대 시공간으로 제어 가능한 화학 주성의 자극에 응답하여 이러한 하나의 살아있는 세포에서 단백질 키나제 D1 같은 시그널링 분자의 GPCR 매개 시공간 역학을 가시화와 YS. 앞선 화상 형성 방법은 일반적으로 주 화성 연구에 적용하고, 포유 동물 세포 시스템에 특히 적합 할 수있다.
본 연구에서는 화성 분석의 두 가지 예 보여 셀 이동 분석 장치에 의해 여러 화학 주성 분석의 첫 번째 동시 모니터링; 그리고 두 번째로, 화학 유인 구배 시각화 실시간으로 동일한 세포에서 이벤트 신호의 시공간 역학.
여러 개의 동시 화성 분석을위한 세포 이동 분석 장치
본 연구에서는 세포 이동 분석 장치를 사용하여 다수의 동시 화학 주성 분석을 수행하는 상세한 프로토콜을 도입했다. 이 장치는 사용자가 기존의 밝은 필드 관찰에 10 배 대물 렌즈로 휴대 화성의 행동을 관찰 할 수 있습니다. 때문에 유체 흐름의 확산 특성을 보이면서, 세포 이동 분석 장치는 매우 예측 가능하고 안정적인 그라디언트를 생성 함과 동시에 수행 될 여섯 화성 분석법까지 허용한다. 프로토콜의 중요한 단계는신뢰할 수있는 그라데이션을 얻었다 테라스 행에 셀을 정렬 할 수 있습니다. 사용자는 엄격 화학 유인 물질과 세포의 홀더 조립 및 사출에 대한 제조업체의 지침을 따라야합니다. 자세한 설명은 또한 온라인으로 사용할 수 있습니다. 대안 화성 11-13,15 방법에 비해,이 장치는 상당히 화성 분석의 신뢰도와 효율을 향상시킨다. 크기의 세포 이동 분석 소자 칩의 네 크기는 4, 5, 6, 8 μm의 다른 유형의 세포의 크기가 수용 가능하다. 우리는 4 또는 5 μm의 세포 이동 분석 장치 칩이 HL60과 D. 적합한 것으로 약 10 내지 15 μm의 직경이다 discoideum 세포. 그러나, 하나의 제한은이 장치는 모든 셀에 적합하지 않다는 것이다. 우리 Raw267.4 세포를 세포 이동 분석 장치 화학 주성 분석을 이용하여 약간의 성공을 거두었 다. 그 이유는 Raw267.4 세포가 너무 느리게 마이그레이션하는 것이 될 수있다. 효율적인 체에 필요한 시간Raw267.4 세포의 motaxis은 그라데이션이 장치에 의해 유지되는 시간보다 훨씬 더 오래있을 수 있습니다. 대신, 트랜스 웰 마이그레이션 분석은 Raw267.4 세포 9 잘했다. 또 다른 한계는 형광 관찰 장치의 현재 불가능하다는 것이다. 향후 방향은 높은 배율과 형광 영상을 모니터하는 것입니다. 이것은 형광 검출 및 100X 대물 렌즈를 구비하는 개선 된 세포 이동성 분석 장치로 할 수있다. 또한, 동시적인 분석의 수가 모든 이러한 개선은 화학 주성 분석법 향상된 처리량과 세포에서 세포 내 마이그레이션 역학의 관찰을 용이하게 12로 증가된다.
HL60 세포의 높은 형질 전환 효율은 형광 단백질 태그 단백질을 발현하는
HL60 세포는 활발히 분할 백혈병 세포주이며, 현탁액에서 성장. 이전에보고 된 바와 같이 18 ~ 20, HL60 세포는 g에 강한엔 전송. 모두 지질 및 전기 유전자 전달이 시험되었고, 전기 천공 후 때문에 일렉트로으로 인한 심각한 피해 높은 형질 전환 효율을 얻기위한 중요한 높은 가능성을 취득 수단 (4)에 상세히 기술 된 바와 같이 높은 형질 전환 효율은 전기 얻었다. 그 후, 철저하고 부드러운 세포 처리는 특히 전기 후 필요합니다. 모든 미디어는 미리 가온하고 부드럽게 일렉트로 후 임의의 단계에서 세포에 첨가해야한다. 또한 전기 시약으로 세포의 노출 시간을 최소화하기 위해 중요하다. 세포 사멸을 방지하기 위해, 전기 천공 한 후, RPMI 1640 일렉트로 복구 매체 즉시 세포에 첨가되어야한다. 우리는 회복 배지에서 20 % FBS를 10 % FBS보다 훨씬 높은 세포 회수율을주는 것을 발견했다. 전기 천공 후, 30 분 동안 전기 RPMI 1640 회복 배지에서 배양 큰 생존하고 형질 감염에 중요한능률. 상기 형질 전환 효율을 증가시키기 위해, 또한 제조자에 의해 추천 된 플라스미드의 대략 두 배 크기이며 형질 당 4 μg의 플라스미드 DNA를 사용 하였다.
단백질 발현과 조로 셀 번호 제한 (형질 전환 당 2 × 106 세포) : 전기 형질 전환에 두 가지 제한이있다. 벡터 플라스미드를 각각의 세포 분열 후 절반으로 희석되기 때문에, 미분화 세포에서 발현 만 세포 분열의 처음 몇시 검출된다. 차별화 된 HL60를 들어 세포는 더 이상 48 시간을 생존하지 않습니다. 그 결과, 모든 실험은 새로운 형질을 실험하기 전 6 시간을 필요로한다. 한 전기의 세포 수는 단지 어떤 생화학 적 분석을위한 최소 요구 사항을 충족합니다. 반복 사용하거나 다량의 목적을 위해, 강하게 미분화 HL60 세포주 안정적 WHI 관심의 단백질을 발현하는 것이 확립 될 것을 권장바이러스 벡터가 사용 가능하며 구성 될 수있는 경우 CH는 바이러스 벡터에 의해 형광 단백질 태그로하고있다.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the intramural fund of NIAID, NIH.
RPMI 1640 Medium GlutaMAX | Life technologies | 61870-036 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scietific | 11360-070 | |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
1M HEPES sterile solution, pH7.3 | Quality Biological Inc. | A611-J848-06 | |
Penicillin streptomycin solution | Fisher Scientific | 15140122 | |
NucleofectorTM 2b | Lonza | AAB-1001 | |
AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettes | Lonza | VCA-1003 | |
Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
2 % Gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution) | Life technologies | 14025-076 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3803 | |
Single well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155361 | |
Four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
Alexa 594 | Thermo Fisher Scientific | A-10438 | |
fMLP | Sigma -Aldrich | F3506-5MG | |
Cover glass thickness 2 22 x 22 mm | Corning | 2855-22 | |
EZ-TAXIScan | Effector Cell Institute, Inc. | MIC-1001 | |
EZ-TAXIScan chip (5 mm) | Effector Cell Institute, Inc. | EZT-F01-5 | |
1701RN 10ul syringe | Hamilton | 80030 | |
Femtotips II Injection tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | |
TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids. | Eppendorf | 5188900056 | |
DIAS software | Solltech Inc. | ||
LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | Carl Zeiss |