In Situ Mærkning af mitokondrie-DNA Replication i Drosophila Adult Ovarier af Edu Farvning

Summary

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

Abstract

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2´-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.

Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

Introduction

Udover den nukleære genom, hver eukaryot celle indeholder også tusindvis af kopier af små cirkulært DNA i den mitokondriske matrix. Mens mitokondrie-DNA (mtDNA) koder væsentlige underenheder af elektrontransportkæden, er de fleste af mitokondrie proteom, herunder alle faktorer for replikation og transkription af mtDNA kodes af det nukleære genom. I modsætning til den nukleare genom, der følger mendelske love arv, er dyret mitokondrie-genomet arvet udelukkende gennem moderens afstamning. Derfor forstå, hvordan mtDNA er spredt, og overføres fra den ene generation til den næste gennem den kvindelige oocyt er fundamentalt vigtigt. Men der er fortsat debat om, hvor mtDNA replikation reguleres i den kvindelige kimcellelinje. Derudover bredt accepterede mtDNA flaskehals teori for mtDNA transmission antyder, at befolkningen i mtDNA i primordiale kimceller subsampled til et relativt lille antal during udvikling ^{1 2.} Det indebærer også, at mtDNA replikation er tidsmæssigt og rumligt reguleret under oogenese. Derfor vil in situ detektion af mtDNA-replikation under kimcellelinje udvikling lette forståelsen af den mekanisme af mtDNA arv.

Drosophila oogenesen tilvejebringer et genetisk medgørlige system til at studere mtDNA replikation og transmission. I hver af de to Drosophila æggestokke, er der 16-20 uafhængige strenge af æg kamre kaldes ovarioles ^3, som er de funktionelle enheder af ægproduktionen (se figur 1A). Hver ovariole indeholder en progressiv lineær organisering af oogenesen hvor den forreste spids består af en struktur kaldet germarium. Den germarium er yderligere opdelt i fire regioner, der indeholder kønsceller på forskellige udviklingsstadier. I region 1, kimlinie stamceller gå gennem asymmetrisk division til at producere datterceller kendt som cystoblasts. Region 2a indeholder cystoblasts som har afsluttet deres endelige division. Cystoblasts gennemgår fire runder af division producerer 16-cellegrupper. De 16 celler forbliver forbundet til hinanden ved cytoplasmatiske broer kaldet ring kanaler. Kun én af cellerne forpligter sig til differentiering som oocytten, mens den anden 15 udvikles som polyploide sygeplejerske celler. En væsentlig cytoplasmatisk struktur, kendt som fusome, foreslås at lette med dannelsen af ring kanaler, fastlægge cyste polaritet og sygeplejersken celle-oocyt-interaktioner ^4,5. Som cysterne bevæge sig i retning region 2b, cyste strukturer spænder over hele bredden af ​​germarium, og bliver mere forbundet med follikelceller. De germarium strukturer ender med region 3 indeholder det første spirende æg kammer. Efterfølgende æg kamre samles på den bageste ende af germarium, som fremskridt gennem ovariole i 14 morfologisk forskellige stadier. Væksten i oocyt afhænger af sygeplejerske celler, whICH transportproteiner, mRNA og endomembrane strukturer (f.eks Golgi) via ringen kanaler i oocytten. Under Drosophila oogenesen blev det konstateret, at en fraktion af mitokondrierne inden for hver 16-celle cyste var forbundet med fusome, bevæges gennem ringen kanaler og blev leveret i det indre oocyt i en stor masse kaldet Balbiani legeme ^6. Dette fænomen blev foreslået at bidrage til kvalitetskontrol af mitokondriel arv gennem kvindelige æggestokke.

Påvisning af mtDNA syntese afhængig inkorporering af mærkede DNA-forstadier i cellulært DNA. Traditionelt blev en nukleosidanalog af thymidin 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU) anvendes til at mærke mtDNA replikation i vævskulturceller ^7,8. Men det antistofbaserede BrdU mærkning udviser flere begrænsninger, især for hel-mount vævsfarvning. En væsentlig ulempe ved BrdU mærkning er, at det kræver DNA denaturering for at blotlæggeBrdU epitop, således at det kan detekteres af anti-BrdU-antistof. Prøven skal behandles under barske denatureringsbetingelser såsom kemikalier (f.eks saltsyre eller blandinger af methanol og eddikesyre), varme eller fordøjelse med DNase, hvilket kan afbryde strukturen af prøven og komplicere følgende farvningsprocedure ^{9, 10.}

Her er en alternativ thymidinanalog 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (edu) anvendes til at mærke replikerende mitokondrie-DNA i Drosophila voksne ovarier. Denne metode er hurtigere og meget følsom. Edu er let inkorporeres i cellulært DNA under DNA-replikation. Følgende detektion er baseret på et "klik" reaktion, en Cu (I) -catalyzed covalent reaktion mellem terminalen alkyngruppe og en fluorescerende azid ^10. Fordi reaktionen ikke kræver denaturering af prøven, det giver god konservering. Endvidere størrelsen af ​​farvestof enzide er kun 1/500 af den for et antistofmolekyle ^10, som muliggør hurtig og effektiv indtrængning af hel-mount væv. Vi har brugt denne metode til at påvise mtDNA replikation under Drosophila oogenesen og fandt en slående rumligt mønster i germarium region Drosophila ovarie ^11, som fører os til at foreslå en replikering-afhængig mtDNA selektiv arv mekanisme. Vi præsenterer her en detaljeret protokol om EDU mærkning af mtDNA replikation i Drosophila æggestokke. For at demonstrere anvendelsen af protokollen, vi også testet den mtDNA replikation i en mtDNA mutant Drosophila (mt: CoI ^{T300I) 11,} samt med diverse behandling af mitokondrie uncouplers, der spreder mitokondriemembranen potentiale og potentielt forstyrre mtDNA replikation.

Protocol

1. Tissue Collection og Dissection I hvert hætteglas indeholdende tørgær, kultur 10 voksne kvindelige flyver med 10 hanner i 2-3 dage. Bemærk: Fastholdelse velnærede kvindelige fluer vil forbedre den overordnede kvalitet og udbytte af æggestok produktion og lette dissektion. Bedøver hunnen flyver på en kuldioxid (CO 2) flyve pad. Under stereoskop, placere flere dråber RT-medium (Schneiders Drosophila medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS)) på en dissekere pad. Gennemføre alle dissektion procedurer i mediet til at holde væv i live og sunde. Snup en opfedet kvindelig flyve med skarpe fin-nosed tænger på sit nedre thorax. Brug et andet sæt af pincet til at rive forsigtigt på den ekstreme bageste af flyve indtil væv i maven er udsat. Frigør de to ovarier fra andre væv (f.eks indvolde). Bemærk: Hver æggestok viser en uigennemsigtig struktur, der er komponered af 16-20 vedhæftede ovarioles. For at øge penetrationen af ​​reagenser, åbne æggestokkene ved at trække dem fra hinanden og passerer spidsen af ​​tangen i mellem hver ovariole et par gange. Hold ovarioles forbundet inden for en æggestok for at minimere tab af væv i de følgende procedurer. Overfør æggestokkene straks til en 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 500 pi Schneiders Drosophila medium med 10% FBS. Gentag dissektion og indsamle 10-15 æggestokke i hvert mikrocentrifugerør. 2. edu Mærkning Aspirer mediet i hvert rør, og erstatte med 500 pi Schneiders Drosophila medium med 10% FBS indeholdende 7 uM aphidicolin. Bemærk: Aphidicolin anvendes til at spærre nuklear DNA-syntese ved inhibering af DNA-polymerase α uden at påvirke mtDNA replikation 7, 12. Det er muligt at forøge koncentrationen af ​​aphidicolin til optil 70 pM for at opnå bedre inhibering. Stamopløsningen af ​​3-30 mM aphidicolin i DMSO kan opbevares i mørke ved -20 ° C i op til 6 uger. For at holde æggestokkene sunde, sikre, at de nedsænkes i løsninger, mens du udskifter mediet. Brug Schneiders Drosophila medium med 10% FBS gennem trin 2.6. Inkuber æggestokke i 3 timer ved stuetemperatur på en bænk-top rocker med forsigtig rotation. Til medicinsk behandling, fx mitokondrie afkobler carbonyl cyanid 4-trifluoromethoxy phenylhydrazon (FCCP), tilsæt passende koncentration af lægemiddel (fx 10 uM FCCP) i mediet efter 2 timer af aphidicolin behandling. Fortsæt inkubation i yderligere 1 time. Fjern mediet indeholdende aphidicolin med eller uden lægemiddel. Kort skylles æggestokkene med medium (aphidicolin er ikke nødvendigt) to gange. Tilsæt 1 ml medium indeholdende 10 uM Edu og 7 uM aphidicolin og fortsætte incubating ved stuetemperatur i 2 timer. 10 mM edu stamopløsning (i DMSO) ved -20 ° C opbevares. Fjern mediet indeholdende Edu og aphidicolin. Vask med medium (uden aphidicolin) to gange i 3 min hver. 3. vævsfiksering og Permeabilisering Der fremstilles en 4% paraformaldehyd-opløsning i phosphatbufret saltvand (PBS, pH 7,4). Bemærk: Vi brugte kommercielt tilgængelige paraformaldehyd gemt i pre-scoret ampuller. Åbn en ny ampul og fortyndes til 4% før brug. ADVARSEL: Formaldehyd er giftigt; Det skal håndteres i et stinkskab med hud og øjenbeskyttelse. Fix æggestokkene med 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved stuetemperatur under forsigtig rotation. Fjern fiksativ og vask æggestokke to gange i 1 ml 3% BSA i PBS i 5 minutter hver gang. For at permeabilisere væv, fjerne vaskeopløsningen og tilsæt 1 ml 0,5% Triton X-100 i PBS. Inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter. Fjern permeabilisering løsningen og vask to gange i 1 ml3% BSA i PBS. 4. Edu Detection Bemærk: edu detektion er baseret på "klik" kemi, en Cu (I) -catalyzed [3 + 2] cycloaddition 13, som tilføjer fluorescerende azider til den terminale alkyn gruppe edu, og det fluorescerende molekyle underkastes efterfølgende detektion. Da Cu (I), som let oxideres til de ikke-katalytiske Cu (II) arter, der kræves til at katalysere reaktionen, anbefales det at reducere Cu (II) sulfat in situ til opnåelse af Cu (I). Det vil sige, Cu (II) sulfat anvendes i nærvær af et reduktionsmiddel, såsom ascorbinsyre (heri den "buffer additiv") til generering af kobber (I). Før forsøget, forberede arbejdsopløsningen af ​​Alexa Fluor azid (Alexa Fluor 488 azid, Alexa Fluor 555 azid eller andre, afhængigt af den foretrukne fluorophor, der er navngivet som "farvestof azid" herefter), edu reaktionsbuffer og edu buffer additiv ifølge producentensinstruktioner. Rekonstituer farvestoffet azid i 70 pi DMSO. arbejdsopløsningen ved -20 ° C i op til 1 år opbevare. Forbered frisk edu reaktionspuffer ved fortynding af 10 x edu reaktionsbuffer med deioniseret vand. Bemærk: Efter brug gemme resterende 1x løsning ved 4 ° C. Den 1x opløsning er stabil i op til 6 måneder. Lav en 10x stamopløsning af edu buffer additiv ved fuldt ud at opløse pulveret i 2 ml deioniseret vand. Bemærk: Denne stamopløsning er stabil i op til 1 år ved -20 ° C. Hvis opløsningen udvikler en brun farve, har det nedbrudt og bør kasseres. Forbered edu reaktion cocktail frisk hver gang, og brug inden for 15 min forberedelse. For at opnå reproducerbare resultater, skal du sørge for reaktionskomponenterne fastholdes på de samme forhold. Lave frisk 1x edu buffer additiv løsning ved fortynding af 10 x stamopløsning (fremstillet i trin 4.1.3) 1:10 i demineraliseret vand. Brug denne solution på samme dag. Forbered 1 ml edu reaktion cocktail ved kombination af de følgende bestanddele i rækkefølge: 860 pi 1x edu reaktionsbuffer, 40 pi CuSO4, 2,5 pi farvestof azid, 100 pi 1x edu buffer additiv. Bemærk: Det er vigtigt, at ingredienserne tilsættes for at sikre optimal ydeevne. Fjern PBS med 3% BSA, og der tilsættes 0,5 ml af edu reaktionen cocktail til hvert rør. Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter under forsigtig rotation. Hold prøverne beskyttet mod lys. Fjern edu reaktionen cocktail og vask en gang med 1 ml 3% BSA i PBS. Vask prøverne en gang med 1 ml PBS. 5. antistofmærkning Bemærk: Udfør antistof mærkning efter Edu farvning. Hvis der ønskes ingen yderligere farvning, kan man fortsætte til montage og billeddannelse direkte. Det er vigtigt, at prøverne skal beskyttes mod lys i alle de følgende procedurer. Fjern vaskeopløsningen. Blokere æggestokkene i 1 ml blokeringsopløsning indeholdende 0,2% BSA og 0,1% Triton X-100 i PBS i 30 min. Den blokerende opløsning fjernes og erstattes med primært antistof fortyndet i blokeringsopløsning (fx mus ATP syntase-underenheden α antistof, 1: 1.000 fortynding). Der inkuberes i mørke ved 4 ° CO / N. Vask prøverne med 1 ml blokerende opløsning 3 gange, 10 minutter hver gang. For at minimere baggrunden, vaskes to gange mere i 30 minutter hver. Den blokerende opløsning fjernes. Inkuber med sekundært antistof fortyndet i blokeringsopløsning (f.eks gede-anti-muse Alexa Fluor 568 sekundært antistof, 1: 200 fortynding) i 2 timer ved stuetemperatur. Bemærk: Brug en anden farve end den, der er koblet til Edu. Gentag vasketrin udføres i trin 5.3. Skyl med 1 ml PBS én gang for at fjerne rensemidlet. 6. Montering og Imaging Fjern forsigtigt alle PBS og immediately dækker æggestokkene med 50 pi monteringsmedium (med eller uden DAPI). Bemærk: Anvend et monterings medium, som ikke hærder mens ovarioles bliver adskilt fra hinanden. Ovarier kan opbevares ved montering medium ved 4 ° C i op til en uge. Skær enden af ​​en pipettespids og bruge det til at overføre æggestokke omhyggeligt på et objektglas. Helt separat hver ovariole med skarpe fin-nosed tænger under stereomikroskop. Fjern de forbindende væv ved den bageste ende og stadie 14 eller modne æg kamre. De unge æg kamre er ved den forreste ende og gennemsigtig. Juster æg kamre med pincet, så de ikke overlapper hinanden. Sænk langsomt en # 1.5 dækglas oven på prøverne. Tillad monteringsmedium til at polymerisere i flere timer ved stuetemperatur. Seal med gennemsigtig neglelak. Billede glider den næste dag, eller opbevares ved 4 ° C før billeddannelse. Visualiser under en konfokal microscope med en 63X olieimmersionsobjektiv. Capture tredimensionelle z-stakke billeder. Bemærk: Der er stærk edu signal i senere stadier æg kamre og baggrund fluorescens i epitel kappe. Ved behandlingen edu mærkning i en bestemt germarium, bør man undgå germariums, der overlappes af eller tæt på andre væv eller senere stadier æg kamre.

Representative Results

Den ovennævnte protokol tillader visualisering af punktformig strukturer i forbindelse med mitokondrier (figur 1B-C), som viser mitokondrie-DNA-replikation under Drosophila oogenese. Den edu puncta lokaliseret med mitokondrier markeret ved farvning for ATP-syntase alpha-underenheden (figur 2). De observerede signaler var til stede i æggestokkene behandlet med ethidiumbromid 11, en inhibitor for mtDNA replikation 14, validere, at disse puncta faktisk etiket replikerende mtDNA.Aphidicolin blev anvendt til at inhibere kerne-DNA-farvning uden at påvirke mtDNA-replikation (figur 2). Uden aphidicolin behandling, intense edu signaler mærke kernerne, og mtDNA puncta var knap opdaget (figur 3). Men i nærværelse af aphidicolin, nuklear inkorporering blev dramatisk reduceret og mange puncta forbundet med mitokondrier blev observeret. <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-side = "1"> Der er en høj grad af mtDNA replikation i post-germarium æg kamre (figur 1b). Men især, mtDNA replikation vises en rumlig mønster i germarium. Som angivet ved antallet af edu puncta, der er en moderat grad af mtDNA replikation i område 1 af germarium, men næsten ingen edu inkorporering i region 2A (figur 1C). Som cyste bevæger sig ned til region 2B i germarium, mtDNA replikation genoptaget, og antallet af edu puncta i den bageste cyste af region 2B var meget højere end den region 2A (figur 1C). Konkret blev intensiv edu inkorporering koncentreret omkring ringen kanaler og fusome strukturer, som farves af hu li tai shao (HTS) protein. mtDNA holdes replikere på et højt niveau i region 3 i germarium (figur 1C) For at demonstrere sammenslutning af specific gener eller behandling med mtDNA proliferation, kan Drosophila ovarier underkastes genmanipulation eller lægemiddelbehandling. Vi behandlede ovarier med forskellige koncentrationer af FCCP, en klassisk mitokondrie protonophore, som afleder mitochondriemembranpotential. Som en kontrol, DMSO havde ingen virkning på mtDNA-replikation (figur 4A). Høje doser af FCCP (10 uM) næsten udtømte mtDNA replikation helt hele germarium (figur 4D). Ikke desto mindre lavere koncentration af FCCP (2 eller 5 uM) havde en mindre virkning på mtDNA replikation i område 1, men inhiberede replikation i regioner 2B og 3 (figur 4B-C), hvilket tyder på områder 2B og 3 er mere følsomme for mitokondrie afbrydelse eller de opretholde relativt langsommere replikation kinetik. De ovennævnte resultater viste, at mtDNA replikering er forbundet med mitochondrial aktivitet. Især forskellige regioner af germarium reagerede forskelligt på mitokondrie impairment. Figur 1. mtDNA replikation under Drosophila oogenesen. (A) Diagram over en Drosophila ovariole og en forstørret visning af germarium. Den ovariole illustrerer fra venstre til højre, forreste til posterior, successive udviklingsstadier af æg kamre. I germarium, er det fusome (rød), kimlinie stamceller (blå), mitokondrier (grøn), fremtidig oocyt (brudt linje, anerkendt af positionering, fusome struktur og mitokondrie klynger), udvikling af cyster (fersken) og fire udviklingsmæssige områder vist . (B) Repræsentant z-stak projektion af en ovariole vildtype mærket af Edu og antistof mod Hts-RC, en markør for ring kanaler og fusome. I nærvær af aphidicolin blev edu inkorporeret i mtDNA (pilespidser) og kerner (pile). Scale bar, 10 um.(C) Forstørret visning af germaria skitseret i indrammede område i B. De fire udviklingsmæssige regioner er vist. Scale bar, 5 um 11. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2. mtDNA replikation i Drosophila germarium visualiseres ved Edu inkorporering med aphidicolin behandling (A) -. (D) Repræsentant konfokal afsnit af en vildtype germarium viser Edu inkorporering (grøn, b), mitokondrier, præget af ATP syntase alpha subunit farvning (rød, C), og kerner, mærket med DAPI-farvning (blå, D) med præ-inkubering med DNA-polymerase-α inhibitor aphidicolin. (A &# 39 ;-D ') En forstørret billede af det indrammede område i (A), der viser Edu inkorporering (B'), mitochondrier (C ') og kerner (D'). I nærvær af aphidicolin, er nuklear inkorporering (pile) reduceret og mange puncta blev lokaliseret i mitochondrierne (pilespidser). Målestokke 10 um. Tallet har været ændret siden 11. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 3. mtDNA replikation næppe påvises i Drosophila germarium uden aphidicolin behandling (A) -. (D) repræsentant konfokal afsnit af en vildtype germarium viser edu inkorporering (grøn), mitochondrier, præget afATP syntase alpha subunit-farvning (rød), og kerner, mærket med DAPI-farvning (blå) i fravær af DNA-polymerasen-α inhibitor aphidicolin. (A'-D ') En forstørret billede af det indrammede område i (A), der viser Edu inkorporering (B'), mitochondrier (C ') og kerner (D'). Uden aphidicolin blev intense edu signaler label kerner (pile), og mtDNA puncta knapt opdaget. Målestokke 10 um. Tallet har været ændret siden 11. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 4. Mitokondriel afkobler forringer mtDNA replikation. Repræsentative z-stack projekter med vildtype germarium behandlet med DMSO(A) eller det mitokondriske afkobleren FCCP ved koncentrationer på 2 uM (B), 5 pM (C), 10 pM (d) under edu inkorporering. Bemærk den svækket edu mærkning i region 2B behandlet med 2 pM FCCP (B), og i både region 2B og 3 behandlet med 5 pM FCCP (skitseret i feltet). Fire udviklingsmæssige regioner er vist. Pile, nuklear DNA; pilespidser, mtDNA. Scale bar, 10 um. Tallet har været ændret siden 11. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Edu mærkning er en ny og effektiv metode til at påvise DNA syntese i prolifererende celler, der er baseret på stiftelse og farvning af nukleosidanaloger i nyligt syntetiseret DNA. Denne metode er overlegen i forhold til den metode BrdU mærkning, idet den er hurtigere og meget følsom. Endnu vigtigere, det giver mulighed for god bevarelse og effektiv edu-dye penetration af hel-mount væv ^{9, 10.} Historisk set som et bedre alternativ til BrdU mærkning, edu mærkning blev anvendt til undersøgelse af kerne-DNA-replikation under S-fase af cellecyklus. Aphidicolin er en inhibitor af DNA-polymerase α, som er den vigtigste polymerase for nuklear DNA replikation ved S-fase ^{12 15.} mtDNA replikation udføres af DNA-polymerase γ, som er ufølsomme for aphidicolin behandling. Derfor behandling med aphidicolin før og under edu inkubation inhiberede signifikant edu inkorporering i kerne-DNA. Det burdebemærkes, at aphidicolin kan være stabil i flere uger, hvis passende lagret, og effekten af ​​aphidicolin hæmme nukleare DNA-replikation var variabel i vores hænder. De ovarioles eller æg kamre med stærke kernekraft DNA-mærkning bør udelukkes fra yderligere dataanalyser.

mtDNA replikation kan let visualiseres som puncta i cytoplasmaet, hvilket også giver en enkel måde at kvantificere niveauet af mtDNA replikation ved at tælle antallet af edu puncta, normaliseret til det totale volumen af ​​cytoplasmaet. Billedbehandlingssoftware kan anvendes til automatisk at identificere edu puncta i mikroskopiske billeder, hvilket er specielt nyttigt for beregningsmæssige analyser af store datasæt. Dog skal der tages forholdsregler, fordi den ufuldstændige hæmning af nuklear DNA-replikation kan føre til Edu inkorporering i særskilte loci på kromosomet og vises som puncta inde i kernen. Også i andre tilfælde, intensiteten af ​​edu inkorporering i opformeringenvelse mtDNA kan være svag, mens baggrunden og støj kan være høj. Derfor bør de enkelte parametre til automatiske billede analyser nøje defineret. Det anbefales også, at billeder skal undersøges med uddannede øjne for at sikre, at de rette edu puncta identificeres.

Visualisering af nyligt syntetiserede mtDNA under Drosophila oogenesen giver mulighed for at undersøge, hvordan mtDNA replikation reguleres under fysiologiske eller patologiske tilstande, ved at udføre eksperimentet i fluer udsat for en række farmakologiske eller genetiske forstyrrelser. I en tidligere undersøgelse blev edu inkorporering assay udføres i en mtDNA mutant Drosophila mt: CoI ^{T300I 11.} Endvidere at forstyrre den mitochondriemembranpotential, ovarier blev behandlet med forskellige koncentrationer af mitokondriel afkobleren FCCP eller 2,4-dinitrophenol (DNP) før edu inkorporering. Afhængigt af de eksperimentelle formålog narkotika egenskaber, kan forskellige metoder vedtages til effektiv levering. For voksne fluer kan lægemidler præsenteres som en damp (f.eks, ethanol og kokain) ^16,17 eller narkotika kan injiceres i maven, hvor det hurtigt diffunderer i hele kroppen ^18. Den mest almindelige praksis er, at lægemidler sættes til flue fødevare eller en sucrose / lægemiddel-mættede filterpapir. For eksempel hæmmer af mikrotubulus-samling, colchicin, blev tilført til fluer til 2-3 dage før ovarie dissektion ^19. Derfor er det vigtigt at evaluere afgivelsesenheden fremgangsmåde og vælge passende koncentrationer.

For at sikre en vellykket billeddannelse af mtDNA replikation i Drosophila æggestokke, skal flere kritiske trin omhyggeligt udført. Fremmest bevare levedygtigheden og sundhed æggestokkene under dissektion og Edu inkorporering er væsentlige (trin 1 og 2). Den Schneiders Drosophila medium med FBS skal opvarmet til stuetemperaturfør brug. Man bør minimere direkte kontakt mellem æg kamre og Dissecting værktøj eller pipettespidser. Æggestokkene bør nedsænkes i løsninger alle tidspunkter for at undgå dehydrering. Forkert håndtering væv kan let føre til at besvime eller ingen fluorescerende signaler. Under væv monterings skridt bør ovarioles adskilles fra hinanden og spredt ud på objektglasset. Sørg ægget kamre er ikke stables oven på hinanden. Vi har bemærket, at de æg kamre uden trin 14 viste lidt edu inkorporering. Derudover grund af den store størrelse, de sene fase æg kamre ofte forårsager de omkringliggende yngre æg kamre at være ude af fokus. Det anbefales derfor, at de sene fase æg kamre kasseres.

Her giver vi en detaljeret protokol til mærkning replikere mtDNA i Drosophila voksne æggestokke. Denne metode giver mulighed for enkel kvantificering af mtDNA replikation under forskellige genetiske og farmakologiske forstyrrelser,og vil være nyttige for at dissekere mekanismerne bag udviklingsmæssig mitokondrie biogenese og mtDNA arv.

Materials

Schneider’s Drosophila medium	Invitrogen	21720-024
FBS	Invitrogen	10100-147
Pair of Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Aphidicolin	Sigma	A0781	Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving.
FCCP	Sigma	C2920
DMSO	Sigma	D2650
Paraformaldehyde, 16% EM grade	Electron Microscopy Sciences	15710	Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection.
PBS	KD Medical	RGF-3190
BSA	Sigma	A7030
Triton X-100	Sigma	T9284
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit	Invitrogen	C10337	EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included
Mouse ATP synthase subunit α antibody, (15H4C4)	MitoSciences	Ab14748	1:1000 dilution
Mouse Hts antibody (clone RC)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	hts RC	1:1000 dilution
Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody	Invitrogen	A-11004	1:200 dilution
Vectashield mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Microscope slide	Fisher Scientific	22-038-103
Nail polish	Elf		Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used.