Her beskriver vi protokoller til at forstyrre pattedyrceller ved solid-state fræsning ved en kryogen temperatur, producerer en celle ekstrakt fra den resulterende celle pulver, og isolere protein komplekser af interesse ved affinitetsindfangning på antistof-koblede micron skala paramagnetiske perler.
Affinitetsindfangning er en effektiv teknik til isolering af endogent protein komplekser til yderligere undersøgelse. Når det bruges sammen med et antistof, er denne teknik også hyppigt omtalt som immunoudfældning. Affinitetsindfangning kan anvendes i en bench-skala og i en high-throughput sammenhæng. Når kombineret med protein massespektrometri, har affinitetsindfangning vist sig at være en arbejdshest af interactome analyse. Selvom der er potentielt mange måder at udføre de mange trin involveret, følgende protokoller implementere vores begunstigede metoder. To funktioner er karakteristisk: anvendelse af cryomilled celle pulver til frembringelse af celleekstrakter, og antistofbaserede koblet paramagnetiske kugler som affinitetsmediet. I mange tilfælde har vi opnået overlegne resultater med dem opnået med mere konventionelle affinitet capture praksis. Cryomilling undgår talrige problemer forbundet med andre former for cellebrud. Det giver effektiv brydning af materialet, og samtidig undgå denatguration spørgsmål i forbindelse med opvarmning eller opskumning. Det bevarer det native protein koncentration på op til punktet af ekstraktion og afbøde makromolekylære dissociation. Det reducerer den tid ekstraherede proteiner tilbringer i opløsning, hvilket begrænser skadelige enzymatiske aktiviteter, og det kan reducere den ikke-specifikke adsorption af proteiner ved affinitetsmediet. Micron skala magnetiske affinitet medier er blevet mere almindeligt i de sidste adskillige år, i stigende grad erstatter den traditionelle agarose- og Sepharose-baserede medier. Primære fordele ved magnetiske medier indbefatter typisk lavere uspecifik proteinadsorption; ingen grænse størrelseseksklusion fordi proteinkompleks binding forekommer på perlen overflade snarere end i porerne; og let manipulation og håndtering ved hjælp af magneter.
En typisk anvendelse af de præsenterede procedurer er at stabilisere og opnå et højt udbytte og renhed af endogent protein komplekser af interesse for interactomic karakterisering 1. Det er underforstået, at dynamiske netværk af både stabilt og forbigående tilknyttede makromolekylære komplekser, hovedsageligt består af proteiner, iscenesætte cellulære processer 2,3. Mens der er mange eksperimentelle metoder til identifikation af protein-protein interaktioner, affinitetsindfangning er blandt de mest anvendte fremgangsmåder til isolering og dissekere fysiologiske proteinkomplekser 4-6. Desuden er denne teknik har den fordel, hvilket gav de makromolekylære komplekser som fysiske entiteter, ikke blot som datapunkter i en read-out; Med fordel kan de opnåede komplekser således anvendes i en lang række yderligere downstream biokemiske, enzymatiske og strukturelle assays 7-9. De præsenterede protokoller er blevet udviklet som reaktion på behovet for at kortlægge Protein-protein interaktion netværk og karakterisere makromolekylære komplekser i deres roller som effektor molekyler af cellebiologi. De er detaljeret med hensyn til deres anvendelse på pattedyrsceller dyrket i vævskultur, men er lige så anvendelig til en bred vifte af biologiske prøver givet passende systemspecifikke tweaks.
Historien om affinitetsindfangning strækker sig tilbage til begyndelsen af det tyvende århundrede med de første immunaffinitetskromatografi eksperimenter – ligner det, der almindeligvis omtales i dag som immunpræcipitering (IP) – optræder i litteraturen fra begyndelsen af 1950'erne. Mainstream brug af teknikken videreudviklet gennem begyndelsen af dette århundrede til i dag 10-13. Diverse celle og molekylærbiologiske undersøgelser har udnyttet mekanisk brud af celler ved formaling ved kryogene temperaturer i mindst de sidste fyrre år 14-19; og molekylære separationer udnytte (super) paramagnetiske perler har becogle mere og mere almindeligt i de sidste to årtier 20. Ved at kombinere disse forskellige teknologier har tjent til synergistisk forbedre resultaterne, der kan opnås i proteinkompleks affinitet capture eksperimenter 1, som det fremgår af en omfattende arbejde produceret af os selv og det bredere samfund forskning 7,9,11,18,19,21 -23. Understøttende Resultaterne er vist i figur 1.
En samling af forbehold og overvejelser, der gælder for udførelse af effektive affinitet capture eksperimenter kan findes i reference 1. Typisk denne fremgangsmåde er mest hensigtsmæssigt at: (I) katalogisere interaktionskandidater af et protein af interesse, dvs bruge protein massespektrometri (MS) til at identificere hidtil ukendte copurifying proteiner (sonderende analyse); (II) assay for tilstedeværelsen af en bestemt interagerende partner, dvs. bruger MS eller western blot at detektere et bestemt protein eller begrænset sæt af proteiner formodes at ispiller sammen med proteinet af interesse (hypotesetest); eller (III) forberede endogent samles proteinkomplekser indeholdende proteinet af interesse til yderligere undersøgelse af yderligere teknikker (præparativ oparbejdning). Før der iværksættes en affinitet capture eksperimentel regime er det absolut nødvendigt at have en høj kvalitet affinitetsreagens, som binder til målproteinet, typisk en IP-kompetent antistof mod det native målprotein af interesse eller mod et tag bundet til et fusionsprotein. Det er også vigtigt at have passende metoder til eksperimentel udlæsning på plads: generel protein farvning (såsom Coomassie blå, SYPRO Ruby, eller sølv, efter SDS-PAGE), western blotting, og protein MS er alle almindeligt anvendt i forbindelse med affinitet capture 1. De præsenterede protokoller udnytte antistof-konjugerede magnetiske perler som affinitetsmediet. Medens funktionen af affinitetsmediet oprindeligt kan valideres i tests, der udnytter få eksperimentelle parametre, tilopnå de bedste resultater hver forsøget bør empirisk optimeret 1,11,24. Protokollerne er adskilt i tre markante faser: (1) udarbejdelse af frosne cellemateriale; (2) cellebrud ved fast tilstand fræsning ved kryogen temperatur; og (3) protein-ekstraktion og affinitetsindfangning under anvendelse af antistof-koblede paramagnetiske perler.
Disse tre protokoller arbejder i tandem til (1) forberede celler til solid state brud ved cryomilling, (2) at opnå brud i en planetarisk kuglemølle, og (3) frembringe ekstrakter fra celle pulver til affinitetsindfangning et protein af interesse i kompleks med dets fysiologiske interaktionskandidater. Der findes mange forskellige celle lysis teknikker, herunder mekaniske / fysiske tilgange beskæftiger knusende effekt, klipning, og / eller tryk, samt kemiske / enzymatiske tilgange, hver med forskellige fordele og ulemper 49,50. Hver investigator opfordres til at udforske metoder mest egnede til deres analyser, at holde sig for øje, at alle valgte metode for celle brud og protein udvinding sandsynligvis indføre skævheder 51,52 nødvendiggør empirisk optimering (omtalt nedenfor). Mekaniske metoder kan producere høj varme og / eller forskydningskræfter, som kan forstyrre protein-komplekser. Cryomilling undgår opvarmning effekter i kraft af at ansætte LN 2 køling af prøver til than varigheden af processen. Planetary kuglemøller forstås til at stole på effekt og friktionskræfter, herunder forskydningsspænding, som dele af partikelstørrelse reduktion 53,54. Ved indstillingerne rapporterede vi har ikke observeret degeneration af proteinkomplekser. Vi har faktisk udvindes og hentet tilsyneladende intakte ~ 50 MDA nukleare pore komplekser 11 og enzymatisk aktive retrotransposons udviser højere specifik aktivitet end præparater beskæftiger 'blid' rengøringsmiddel-baserede lyse 7. Kemiske / enzymatiske metoder til cellelyse lider den begrænsning, at indholdet af cellen frigives i et in vitro miljø, der støtter sprængning af cellemembraner og strukturelle makromolekyler men kan ikke være egnet til opretholdelse af integriteten af proteinkomplekset (es ) af interesse. Ofte, hverken bestanddelene af komplekserne dannet med proteinet af interesse eller betingelserne nødvendige for at stabilisere mål-komplekser erkendt på forhånd. En stor fordel ved solid-state fræsning er, at brud og udvinding er frakoblet, tillader kildemateriale at være forberedt fri af tilsat væske, lagret (ved -80 ° C eller derunder), samlet, og bekvemt hentes til on-demand eksperimenter; fx, udforske til optimeret in vitro betingelser for affinitet fange. Protein-interaktioner er mest stabile ved høj koncentration 55,56, derfor minimere mængden af ekstraktionsmiddel kan være fordelagtigt for at bevare fysiologiske interaktioner. På den anden side er der praktiske overvejelser – proteinkomplekserne behøver at blive delt ud af cellerne og ind i en ikke-viskøs vandfase, fri for uopløselige aggregater, med henblik på at blande de mål-komplekser med affinitetsmediet. Desuden er der behov vis standardisering og kontrol over in vitro miljø (pH, saltkoncentration, etc.) til systematisering og reproducerbarhed. Vi finder, at ekstrakter produced i fortynding på 1: 4-1: 9 (w: v) opfylde praktiske og teoretiske problemer, giver resultater af høj kvalitet. For endvidere at den optimale andel af celleekstrakt til affinitetsmediet behov bestemmes. Dette gøres empirisk ved titrering af ekstrakter med varierende mængder af affinitetsmedium og kan have påviselige virkninger på signal-til-støj-forholdet af eksperimentet yderligere nedenfor. En fremragende udtømning af målproteinet er typisk ≥70% af den opløselige fraktion af målproteinet, men> 90% er ønskelig og vil kunne opnås med omhyggelig parametrering af ekstraktionsbetingelserne. Mange sådanne praktiske overvejelser er dækket i reference 1. Paramagnetiske kugler manipuleres ved hjælp neodym magneter i en specialiseret mikrocentrifugerør holder, selvom hjemmelavede alternativer er levedygtige. Når det placeres i holderen, perler samles på siden af røret under indflydelse af det magnetiske felt. Opløsninger kan derefter fjernes uden disturbing perlerne.
En begrænsning af den præsenterede cryomilling protokol, udviklet med det planetariske kuglemølle bruges her (se tabel of Materials), er, at et minimum af materiale er påkrævet for effektivt mølle og genvinde celle pulver ved hjælp af denne enhed (> 1 g). Sådanne mængder kan let opnås med mange mikrober, cellelinjer og modelorganismer, og kan også ofte opnås med væv udskåret fra laboratoriedyr. Dog kan visse cellelinjer være meget vanskelige at dyrke i overflod og animalske væv, kan være sparsomme. Mindre mængder af materiale kan sammenligneligt formales ved hjælp af andre enheder anvender mindre beholdere, selv kan blive offer af pulveret finhed opnået. Endvidere kan omkostningerne til mekaniske formalingsanordninger være uoverkommeligt dyrt for laboratorier. Cryomilling kan opnås ved anvendelse af en række alternative opstillinger 14-19, herunder, mest billigt i hånden ved hjælp et skadedyrle og mørtel, selv om brud effektivitet falder betydeligt. Affinitetsindfangning protokoller sigter typisk for en høj effektivitet af cellelysis for at lette maksimal protein ekstraktion i opløsning og dermed maksimal potentiale for indfangning af målproteinet komplekser. På den anden side er det blevet påvist for gær in vitro splejsning ekstrakter at maksimal lysis ikke kan sidestille med maksimal in vitro biokemisk aktivitet 57,58. Vi har ikke observeret sådanne problemer i de systemer, vi har testet indtil nu, og derfor ikke bevidst begrænse vores cellebrud når cryomilling. Ikke desto mindre bør denne mulighed tages i betragtning, når du optimerer for in vitro enzymatiske assays. Selvom cryomilling er en meget effektiv metode til at bryde celler, en begrænset mængde af lydbehandling ofte gavner produktionen homogene helcelleekstrakter fra pattedyrvæv fordi inhomogene aggregater tider kan observeres ved visuel inspektion: typiski ekstraktionsbetingelser anvendelse af lav til moderat salt (100-300 mM) og ikke-ionisk detergent (0,1-1% v / v) koncentrationer. Fordi vi observeret, at tilstedeværelsen af disse aggregater kan reducere udbyttet og / eller kvaliteten af den efterfølgende affinitet capture, vi rutinemæssigt implementere sonikering for at dispergere dem (selv når de ikke er observeret med det blotte øje). Aggregaterne er i overensstemmelse med agglomererede membran fragmenter, svarende til dem, der tidligere er rapporteret i ekstrakter fra fræsede gærceller 58. Lydbehandling bruges også i nogle protokoller for forskydning DNA og befri kromatin fragmenter i opløsning, men graden af lydbehandling anvendt i denne protokol omfatter ikke mærkbart fragment DNA. Den begrænsede tilgængelighed (eller de høje omkostninger) af en fremragende affinitetsligand eller antistof mod det bestemte protein af interesse kan være en anden hindring. En bred vifte af kommercielt tilgængelige affinitet reagenser kan udnyttes når modellen organisme er modtagelig for genomisk tagging eller transfection med ektopiske ekspressionsvektorer, der tillader ekspression af proteiner af interesse som affinitetsmærkede fusionerne. Imidlertid er produktionen af tilpassede antistoffer bliver stadig mere realistisk og begge polyklonale og monoklonale antistoffer kan udføre udmærket i capture applikationer affinitet. Disse mange overvejelser er også omfattet nærmere i reference 1.
Eksempler på, hvordan cellelyse fremgangsmåde og valg af affinitetsmedium kan påvirke Resultaterne er illustreret i figur 1. Eksempler på effekter, der udøves af forskellige ekstraktionsmidler kan ses i referencer 1,11,24. Fordi disse og andre eksperimentelle parametre påvirker kvaliteten af affiniteten indfangning, hvilket gør det vanskeligt at skelne RP'er, at lagre af "vulst proteomer" og beregningsmæssige metoder fjerne ikke-specifikke forurenende stoffer er blevet udviklet til at hjælpe med at identificere RP'er 40-43. Ikke desto mindre, kun sådanne tilgange substitute for optimal prøveforberedelse i begrænset omfang 59. Observation af bedste praksis og empirisk optimere affinitet capture forsøget vil give den højeste prøver kvalitet for downstream analyser yderligere diskuteret nedenfor. En let gennemføres praksis, der kan forbedre prøve renhed er hjemmehørende eluering. Native eluering Oftest anvendes til at opnå affinitet isolerede protein kompleks, intakt, med henblik på yderligere forsøg; men som det ofte øger prøve renhed, det kan også anvendes alene af den grund. Men som vist i figur 1, felt II, kan evnen hos nativt eluering at forbedre prøven renhed afhænge af en nøjagtig titrering af mængden af affinitetsmedium til overflod af målproteinet i celleekstrakten – når mediet er i overskud , ubesatte paratoper kan tillade off-target ophobning af FP proteiner observerbare i oprindeligt eluerede fraktioner. Anvendelse af reagenserne og fremgangsmåderne beskrevet her, det hsom været vores erfaring, at den største enkeltstående bidragyder af rammeprogrammerne til vores eksperimenter er den mærkede protein selv engang fjernet fra rammerne af den levende celle. (Fig. 1, del II og fig. S1). I sådanne tilfælde parentale cellelinje kontroller, der giver irrelevante proteomer i fravær af antigenet er uden praktisk værdi; ligeledes for tag-only eller spike-in kontroller, der er blottet for alt andet end målantigenet. Derfor, når praktisk vi gennemfører I-DIRT 7,38, som direkte måler akkumuleringen af efter lyse proteininteraktioner ved anvendelse af kvantitative MS. Som nævnt i trin 3.2.7 af protokollen, vil procedurerne for indfødte eluering variere med detaljerne i affinitet, der anvendes. Native eluering er mest almindeligt opnås ved kompetitiv fortrængning af den mærkede protein-kompleks eller proteolytisk spaltning af fragmentet, frigive komplekset fra affinitetsmediet. Adskillige affinitet systemer bestående af små epitopmærker eksisterer, for som epitopen selv er tilgængelig som peptid nyttig til kompetitiv eluering af taggede proteinkomplekser 60. Ligeledes flere proteaser er tilgængelige til specifikt at spalte beslægtede sites strategisk placeret i affinitetsmærkede fusionsproteiner 61. Afhængigt af detaljerne i de valgte affinitet systemer, kan vedtages en passende eluering ordningen.
Almindeligvis vil kvaliteten af de opnåede resultater blive væsentligt påvirket af kvaliteten af præparatet prøven. Det er vigtigt at arbejde omhyggeligt og præcist gennem hvert trin af disse protokoller, og så hurtigt som muligt og samtidig opretholde omhu og præcision. Det er tilrådeligt at spore opdeling af proteinet af interesse gennem hvert trin for at forstå effektiviteten af hver manipulation. For eksempel: hvordan rigelige er proteinet af interesse i cellen eller vævet pågældende? Måske proteinet under undersøgelse (og dets komplekser) vil være en udfordring at karakterisere i massespektrometri på grund af lav overflod. Hvis de rensede komplekser er påviselige ved almindelig protein-farvning (ca. nanogram rækkevidde), massespektrometri er tilbøjelige til at lykkes. Hvis der kun kan detekteres det indfangede protein af interesse ved følsomme forstærket kemiluminescerende western blotting (ca. picogram), massespektrometri er mindre tilbøjelige til at være effektive. Selv hvis proteinet af interesse er rigeligt i cellen, hvor rigelige er det i cellen ekstrakt fremstillet? Er det protein partition til løsningen, eller er det i pillen? Hvis sidstnævnte, kan en ny udsugningsløsning udtænkes, der kan forbedre inddrivelsen. Når celleekstrakt kombineres med affinitet medium, hvor effektivt proteinet indfanges? Er proteinet forbliver bundet gennem efterfølgende vaske? Hvad med andre copurifying proteiner? Ved at gemme en portion af hver prøve på passende trin i protokollen disse spørgsmål let kan besvares, typisk ved western blotting mod proteinet af interesseeller generel proteinfarvning, men andre assays kan også være egnede. Optimering hvert trin vil forøge udbyttet og renheden af tilfangetagne komplekser, selvom der kan være en afvejning, der skal foretages i maksimering én attribut eller det andet.
En typisk anvendelse af affinitetsindfangning for mange forskere er at identificere kandidat in vivo interaktionskandidater for et lille antal proteiner af interesse; disse kandidater er almindeligt udsat for validering af ortogonale tilgange in vivo for at demonstrere den biologiske betydning af de fysiske interaktionskandidater. Affinity capture også ansat af high-throughput undersøgelser for at generere lister over copurifying proteiner observeret på en (næsten) proteom-plan, letter beregningsmæssige slutninger vedrørende formodede in vivo-komplekser. Talrige eksempler på sådanne undersøgelser kan findes i litteraturen. Denne tilgang afkald optimering af betingelserne for fangst for enhver given mål til fordel for at udforske mandy mål; Som sådan er den udledte komplekser selv er sjældent hentes helt intakt og meget rent i en given prøve. , De partielle overlapninger i kompositioner observeret mellem mange forskellige affinitet-erobrede prøver anvendes Snarere som grundlag for de slutninger 42. Begge tilgange bidrager værdifulde data til vores forståelse af interactome. Ikke desto mindre er en stor fordel af affinitet capture er, at det ofte ikke giver mulighed for at opnå komplekserne intakt og højt oprenset, forudsat at der gøres en indsats for at optimere proceduren. Vi mener, at fremtiden for tilgang ligger i at øge den lethed og effektivitet optimering erobringen af endogene protein komplekser 11, for mere præcis vurdering af viften af fysiologiske interaktionskandidater og mere hyppig brug i længere nedstrøms biokemiske, enzymologisk og strukturelle studier, fx referencer 7,9,23.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker professor Brian T. Chait for hans uvurderlige råd, støtte og adgang til MS instrumentering, samt Ms Kelly R. Molloy for fremragende teknisk support. Vi takker Ms Kelly Bare for støtte med kopi redigering. Dette arbejde blev støttet delvist af NIH tilskud P41GM109824, P41GM103314, og P50GM107632.
Growth media & cell culturing implements | For producing frozen cells (I) | ||
500 cm^2 culture dishes | Corning | 431110 | For producing frozen cells (I) |
Large beaker (1-2L) | For producing frozen cells (I) | ||
Rectangular ice pan | Fisher Scientific | 13-900-747 | For producing frozen cells (I), & cryomilling (II) |
Phosphate buffered saline (PBS) | For producing frozen cells (I) | ||
Large cell scrapers | Fisher Scientific | 08-100-242 | For producing frozen cells (I) |
Liquid nitrogen | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
50 ml conical tubes | Corning | 352098 | For producing frozen cells (I), & cryomilling (II) |
20 ml Luer lock syringe | For producing frozen cells (I) | ||
Leur lock syringe caps | www.dymax.com | T11182 | For producing frozen cells (I) |
Refrigerated centrifuge | For producing frozen cells (I) | ||
50 ml tube rack, 4 position | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
Styrofoam box | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
Planetary ball mill, PM 100 | Retsch | 20.540.0001 | For cryomilling (II) |
Stainless steel milling jar, 50 ml | Retsch | 01.462.0149 | For cryomilling (II) |
Stainless steel milling balls, 20 mm Ø | Retsch | 05.368.0062 | For cryomilling (II) |
Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm | www.marcorubber.com | T1044-2.62×44.63 | For cryomilling (II) |
mini-LN2 decanter | homemade | see Ref 19 | For cryomilling (II) |
250 ml PTFE jar insulator (optional) | Retsch | custom order | For cryomilling (II) |
PTFE puck insulator (optional) | homemade | The Rockefeller University | For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request. |
5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional) | http://www.leeimh.com/ | 558 series check valve | For cryomilling (II) |
1.5 – 2 ml microfuge tubes | For affinity capture (III) | ||
Extractant | For affinity capture (III) | ||
cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Applied Science | 11873580001 | For affinity capture (III) |
Vortex mixer | For affinity capture (III) | ||
Ice bucket | For affinity capture (III) | ||
Microtip sonicator, Q700 | Qsonica | Q700 | For affinity capture (III) |
low intensity 1/16” microtip probe | Qsonica | 4717 | For affinity capture (III) |
Bench-top refrigerated microcentrifuge | For affinity capture (III) | ||
Dynabeads M-270 Epoxy | Thermo Fisher | 14302D | For affinity capture (III) |
Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads | homemade | For affinity capture (III); see reference 19 | |
Sample rotator | For affinity capture (III) | ||
Neodymium magnet | Life Technologies | 123-21D | For affinity capture (III) |
SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent) | For affinity capture (III) | ||
DTT | For affinity capture (III) | ||
SDS-PAGE system | For affinity capture (III) | ||
SDS-polyacrylamide gel | For affinity capture (III) | ||
Protein Stain | For affinity capture (III) |