यहाँ हम एक क्रायोजेनिक तापमान पर ठोस राज्य मिलिंग द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं को बाधित जिसके परिणामस्वरूप सेल पाउडर से एक सेल निकालने का उत्पादन, और एंटीबॉडी मिलकर माइक्रोन पैमाने समचुंबक मोती पर संबंध कब्जा द्वारा ब्याज की प्रोटीन परिसरों को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है।
संबंध कब्जा आगे के अध्ययन के लिए अंतर्जात प्रोटीन परिसरों को अलग-थलग करने के लिए एक प्रभावी तकनीक है। जब एक एंटीबॉडी के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है, इस तकनीक को भी बार बार करने के लिए immunoprecipitation के रूप में जाना जाता है। संबंध कब्जा एक बेंच पैमाने में और एक उच्च throughput संदर्भ में लागू किया जा सकता है। जब प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर संबंध कब्जा interactome विश्लेषण का एक workhorse साबित हो गया है। हालांकि वहाँ कई शामिल कदम पर अमल करने के लिए संभावित कई तरीके हैं, निम्नलिखित प्रोटोकॉल हमारे इष्ट तरीकों को लागू करने। दो सुविधाओं विशिष्ट हैं: cryomilled सेल पाउडर का उपयोग आत्मीयता के माध्यम के रूप में सेल के अर्क, और एंटीबॉडी युग्मित समचुंबक मोती उत्पादन के लिए। कई मामलों में, हम और अधिक परंपरागत संबंध कब्जा प्रथाओं के साथ प्राप्त उन लोगों के लिए बेहतर परिणाम प्राप्त किया है। Cryomilling सेल टूटना के अन्य रूपों के साथ जुड़े कई समस्याओं से बचा जाता है। यह सामग्री के कुशल टूटना प्रदान करता है, जबकि denat परहेजuration हीटिंग या झाग के साथ जुड़े मुद्दों। यह निकासी की बात करने के लिए मूल निवासी प्रोटीन एकाग्रता को बरकरार रखे हुए है, macromolecular हदबंदी को कम। यह समय निकाले प्रोटीन समाधान में खर्च करते हैं, हानिकारक enzymatic गतिविधियों को सीमित करने को कम कर देता है, और यह आत्मीयता के माध्यम से प्रोटीन की गैर विशिष्ट सोखना कम कर सकते हैं। माइक्रोन पैमाने चुंबकीय आकर्षण मीडिया में पिछले कई वर्षों से अधिक आम हो गए हैं, तेजी से पारंपरिक agarose- और Sepharose आधारित मीडिया की जगह ले। चुंबकीय मीडिया का प्राथमिक लाभ आम तौर पर कम गैर विशिष्ट प्रोटीन सोखना शामिल हैं; कोई आकार अपवर्जन सीमा नहीं है क्योंकि प्रोटीन जटिल बाध्यकारी नहीं बल्कि pores के भीतर से मनका सतह पर होता है; और और गड़बड़ी की आसानी निपटने चुंबक का उपयोग।
प्रस्तुत प्रक्रियाओं का एक विशिष्ट आवेदन interactomic लक्षण वर्णन 1 के लिए स्थिर और एक उच्च उपज और ब्याज की अंतर्जात प्रोटीन परिसरों की पवित्रता को प्राप्त करने के लिए है। समझा जाता है कि दोनों stably और क्षणिक जुड़े macromolecular परिसर, मुख्यतः प्रोटीन के शामिल के गतिशील नेटवर्क, सेलुलर प्रक्रियाओं 2,3 आर्केस्ट्रा। जबकि वहाँ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान करने के लिए कई प्रयोगात्मक दृष्टिकोण हैं, संबंध कब्जा अलग और शारीरिक प्रोटीन परिसरों 4-6 विदारक के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तरीकों में से एक है। इसके अलावा, इस तकनीक को न सिर्फ एक पढ़ने के लिए बाहर में डेटा बिंदुओं के रूप में भौतिक संस्थाओं, के रूप में macromolecular परिसर उपज का लाभ दिया है; हितकर, प्राप्त परिसरों इस प्रकार अतिरिक्त बहाव के जैव रासायनिक, एंजाइमी, और संरचनात्मक assays 7-9 की मेजबानी में इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल protei नक्शा करने के लिए जरूरत के जवाब में विकसित किया गया हैn, प्रोटीन बातचीत नेटवर्क और कोशिका जीव विज्ञान के प्रेरक अणुओं के रूप में उनकी भूमिकाओं में macromolecular परिसर की विशेषताएँ। वे ऊतक संस्कृति में विकसित स्तनधारी कोशिकाओं के लिए उनके आवेदन के संबंध में विस्तृत रहे हैं, लेकिन उचित प्रणाली विशेष तोड़ मरोड़ दिया जैविक नमूने की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए समान रूप से लागू होते हैं।
संबंध कब्जा का इतिहास बीसवीं सदी के शुरू करने के लिए पहली immunoaffinity क्रोमैटोग्राफी प्रयोगों के साथ फैला है – जैसी है जो आमतौर पर आजकल कहा जाता है immunoprecipitation के रूप में (आईपी) – 1950 के दशक से साहित्य में दिखाई दे। तकनीक की मुख्यधारा के उपयोग के आगे उपस्थित 10-13 के लिए इस सदी के अंत के माध्यम से विकसित की है। विविध सेल और आणविक जैविक अध्ययन में कम से कम पिछले चालीस वर्षों 14-19 के लिए क्रायोजेनिक तापमान पर मिलिंग द्वारा कोशिकाओं के यांत्रिक टूटना का उपयोग किया है; और आणविक (सुपर) समचुंबक मोती का उपयोग विभाजन बीईसी हैome पिछले दो दशकों में 20 से अधिक तेजी से सामान्य। इन विभिन्न प्रौद्योगिकियों के संयोजन के रूप में काम खुद के द्वारा उत्पादित की एक व्यापक शरीर और व्यापक अनुसंधान समुदाय इसका सबूत है, synergistically परिणाम है कि प्रोटीन जटिल संबंध कब्जा प्रयोगों 1 में प्राप्त किया जा सकता सुधार करने के लिए सेवा की है 7,9,11,18,19,21 -23। सहायक परिणाम चित्रा 1 में प्रस्तुत कर रहे हैं।
निरंतर और प्रभावी संबंध कब्जा प्रयोगों को क्रियान्वित करने के लिए लागू विचारों की एक संग्रह संदर्भ 1 में पाया जा सकता है। आमतौर पर इस दृष्टिकोण के लिए सबसे उपयुक्त है: (i) ब्याज की एक प्रोटीन की interactors सूची है, यानी, प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) का उपयोग अब तक अज्ञात copurifying प्रोटीन (खोजपूर्ण विश्लेषण) की पहचान करने के लिए; (द्वितीय) के लिए एक विशेष बातचीत साथी की उपस्थिति के लिए परख, यानी, एमएस या पश्चिमी धब्बा का उपयोग करने के संदिग्ध एक विशेष प्रोटीन या प्रोटीन के सीमित सेट का पता लगाने केब्याज (परिकल्पना परीक्षण) के प्रोटीन के साथ teract; या (iii) endogenously इकट्ठे प्रोटीन अतिरिक्त तकनीक से आगे के अध्ययन (प्रारंभिक workup) के लिए ब्याज की प्रोटीन युक्त परिसरों तैयार करते हैं। एक आकर्षण कब्जा प्रयोगात्मक शासन पर तैयार कर पहले यह एक उच्च गुणवत्ता आत्मीयता के अभिकर्मक कि लक्ष्य प्रोटीन, या ब्याज के मूल लक्ष्य प्रोटीन के खिलाफ एक और टैग को एक संलयन प्रोटीन के साथ संलग्न के खिलाफ आम तौर पर एक आईपी सक्षम एंटीबॉडी को बांधता है करने के लिए जरूरी है। सामान्य प्रोटीन धुंधला हो जाना, पश्चिमी सोख्ता, और प्रोटीन एमएस (जैसे Coomassie नीले, Sypro रूबी, या चांदी, निम्नलिखित एसडीएस पृष्ठ के रूप में) सभी आमतौर संबंध कब्जा के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं: यह भी जगह में प्रयोगात्मक readout के उचित तरीकों के लिए महत्वपूर्ण है 1। प्रस्तुत प्रोटोकॉल आत्मीयता के माध्यम के रूप में एंटीबॉडी संयुग्मित चुंबकीय मोतियों का उपयोग। आत्मीयता के माध्यम के समारोह शुरू करने के लिए, परीक्षण है कि कुछ प्रयोगात्मक मापदंडों का उपयोग में मान्य किया जा सकता हैसबसे अच्छा परिणाम एक प्रयोग के अनुभव से 1,11,24 अनुकूलित किया जाना चाहिए प्राप्त करते हैं। प्रोटोकॉल तीन विशिष्ट चरणों में विभाजित हैं: (1) जमे हुए सेल सामग्री की तैयारी; (2) क्रायोजेनिक तापमान पर ठोस राज्य मिलिंग द्वारा सेल टूटना; और (3) प्रोटीन निकासी और आत्मीयता कब्जा एंटीबॉडी युग्मित समचुंबक मोती का उपयोग कर।
ये तीन प्रोटोकॉल मिलकर काम करने के लिए (1), cryomilling द्वारा ठोस राज्य टूटना लिए कोशिकाओं को तैयार (2) एक ग्रहों गेंद चक्की में टूटना प्राप्त करने, और (3) को पकड़ने के साथ परिसर में ब्याज की एक प्रोटीन से एफ़िनिटी के लिए सेल पाउडर से अर्क का उत्पादन अपनी शारीरिक interactors। कई अलग अलग सेल तकनीक मौजूद है, यांत्रिक / शारीरिक कुचल प्रभाव, बाल काटना, और / या दबाव को रोजगार के दृष्टिकोण, साथ ही रासायनिक / एंजाइमी दृष्टिकोण, विभिन्न पेशेवरों और विपक्ष 49,50 के साथ प्रत्येक शामिल है। प्रत्येक अन्वेषक मन है कि सेल टूटना और प्रोटीन निकासी के लिए किसी भी चुना दृष्टिकोण पूर्वाग्रहों 51,52 अनुभवजन्य अनुकूलन (नीचे) पर चर्चा की जरूरत महसूस शुरू करने की संभावना है में रखते हुए उनके विश्लेषण के लिए सबसे उपयुक्त तरीकों का पता लगाने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है। यांत्रिक तरीकों उच्च गर्मी और / या बाल काटना बलों जो प्रोटीन परिसरों को बाधित कर सकते हैं उत्पादन हो सकता है। Cryomilling रोजगार टी के लिए नमूने एल एन 2 ठंडा करने की हैसियत से हीटिंग प्रभाव से बचा जाता हैवह प्रक्रिया की अवधि। ग्रहों की गेंद मिलों कण आकार में कमी 53,54 के घटक के रूप कतरनी तनाव सहित प्रभाव और घर्षण बलों, पर भरोसा करने के लिए, समझ रहे हैं। सेटिंग्स पर सूचना दी कि हम प्रोटीन परिसरों का अध: पतन नहीं मनाया है। वास्तव में हम निकाला और जाहिरा तौर पर बरकरार ~ 50 एमडीए परमाणु ताकना परिसरों 11 और enzymatically सक्रिय रोजगार 'कोमल' डिटर्जेंट आधारित सेल 7 तैयारियों की तुलना में अधिक विशिष्ट गतिविधि का प्रदर्शन करते retrotransposons लिया गया है। सेल के रासायनिक / एंजाइमी तरीकों सीमा यह है कि सेल की सामग्री को इन विट्रो परिवेश कोशिका झिल्ली और संरचनात्मक अणुओं के विघटन का समर्थन करता है लेकिन प्रोटीन जटिल की अखंडता को बनाए रखने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है कि (es में जारी कर रहे हैं से ग्रस्त ) ब्याज की। अक्सर, न परिसरों के घटक ब्याज की प्रोटीन के साथ बनाई है और न ही स्थिति को स्थिर करने के लिए लक्ष्य परिसरों हैं की जरूरतअग्रिम में जाना जाता है। ठोस राज्य मिलिंग का एक प्रमुख लाभ यह है कि टूटना और निकासी uncoupled हैं, स्रोत सामग्री की अनुमति देने, कहा तरल से मुक्त करने के लिए तैयार किया, (-80 डिग्री सेल्सियस या नीचे) पर संग्रहीत कमाया, और आसानी से मांग पर प्रयोग के लिए लिया गया है; उदाहरण के लिए, आत्मीयता को पकड़ने के लिए इन विट्रो की स्थिति में अनुकूलित पता लगाने के लिए। प्रोटीन बातचीत उच्च एकाग्रता 55,56 पर सबसे अधिक स्थिर रहे हैं, इसलिए न्यूनतम करने निकासी की मात्रा शारीरिक बातचीत के संरक्षण के लिए फायदेमंद हो सकता है। दूसरी ओर, वहाँ व्यावहारिक विचार कर रहे हैं – प्रोटीन परिसरों, कोशिकाओं के बाहर और एक गैर चिपचिपा जलीय चरण, अघुलनशील समुच्चय के लिए मुफ्त में विभाजित किया जा करने के लिए आदेश आत्मीयता के माध्यम के साथ लक्ष्य परिसरों आपस में मिलना में की जरूरत है। इसके अलावा, कुछ मानकीकरण और इन विट्रो पर्यावरण (पीएच, नमक एकाग्रता, आदि) पर नियंत्रण systematization और reproducibility के लिए आवश्यक है। हम जानते हैं कि जनसंपर्क के अर्क लगानेके कमजोर पड़ने रेंज में oduced 1: 4-1: 9 (डब्ल्यू: वि) व्यावहारिक और सैद्धांतिक चिंताओं, गुणवत्ता परिणाम उपज को संतुष्ट। इसके अतिरिक्त, सेल निकालने का इष्टतम अनुपात मध्यम जरूरतों से एफ़िनिटी के लिए निर्धारित किया जाना है। इस संबंध माध्यम की मात्रा बदलती के साथ अर्क का अनुमापन द्वारा अनुभव से किया जाता है और प्रयोग के संकेत करने वाली शोर अनुपात पर पहचाने जाने प्रभाव हो सकता है, आगे से नीचे चर्चा की। लक्ष्य प्रोटीन की एक बहुत कमी आम तौर पर लक्ष्य प्रोटीन की घुलनशील अंश का ≥70% है, लेकिन> 90% वांछनीय है और निकासी की स्थिति से सावधान parameterization के साथ प्राप्त किया जा सकता है। कई ऐसे व्यावहारिक दृष्टिकोण संदर्भ 1 में कवर कर रहे हैं। समचुंबक मोती, एक विशेष microcentrifuge ट्यूब धारक में neodymium चुंबक का उपयोग चालाकी हालांकि घर का बना लिए विकल्प व्यवहार्य हैं। जब धारक के भीतर रखा, मोती चुंबकीय क्षेत्र के प्रभाव में ट्यूब के पक्ष में इकट्ठा। समाधान तो di बिना हटाया जा सकता हैमोती sturbing।
प्रस्तुत cryomilling प्रोटोकॉल की एक सीमा है, यहां इस्तेमाल किया ग्रहों की गेंद चक्की के साथ विकसित (सामग्री की तालिका देखें), कि सामग्री की एक न्यूनतम राशि को प्रभावी ढंग से मिल करने के लिए आवश्यक है और इस डिवाइस (> 1 ग्राम) का उपयोग सेल पाउडर ठीक हो जाता है। इस तरह की मात्रा में आसानी से कई रोगाणुओं, सेल लाइनों, और मॉडल जीवों के साथ प्राप्त कर रहे हैं, और यह भी अक्सर प्रयोगशाला जानवरों से excised ऊतकों के साथ प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, कुछ सेल लाइनों के लिए बहुत मुश्किल बहुतायत और जानवरों के ऊतकों में विकसित करने के लिए दुर्लभ हो सकता है हो सकता है। सामग्री की छोटी मात्रा तुलनात्मक पाउडर सुंदरता हासिल की बलिदान पर छोटे कंटेनरों का उपयोग अन्य उपकरणों का उपयोग कर milled किया जा सकता है, हालांकि संभवतः। इसके अलावा, यांत्रिक मिलिंग उपकरणों की लागत कुछ प्रयोगशालाओं के लिए बेहद महंगा हो सकता है। हाथ से Cryomilling विकल्प setups 14-19 के एक नंबर का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता, सहित, सबसे affordably एक कीट का उपयोग करLe और मोर्टार, हालांकि टूटना दक्षता काफी चला जाता है। संबंध कब्जा प्रोटोकॉल आम तौर पर सेल के एक उच्च दक्षता के समाधान में अधिक से अधिक प्रोटीन निकासी और इसलिए, लक्ष्य प्रोटीन परिसरों के कब्जा करने के लिए अधिक से अधिक संभावित सुविधा प्रदान करने के लिए लक्ष्य। दूसरी ओर, यह इन विट्रो splicing में खमीर के लिए प्रदर्शन किया गया है निकालता है कि अधिक से अधिक सेल इन विट्रो जैव रासायनिक गतिविधि 57,58 में अधिक से अधिक के साथ समानता नहीं हो सकती है। हम सिस्टम हम इस प्रकार अब तक का परीक्षण किया है में इस तरह की समस्याओं को नहीं देखा है, और जब cryomilling इसलिए जानबूझकर अपने सेल टूटना सीमित नहीं है। फिर भी, इस संभावना को ध्यान में रखते हुए जब इन विट्रो enzymatic assays के लिए अनुकूलन वहन किया जाना चाहिए। हालांकि cryomilling कोशिकाओं को तोड़ने के लिए एक अत्यधिक प्रभावी तरीका है, sonication के एक सीमित मात्रा में अक्सर स्तनधारी ऊतकों से उत्पादन समरूप पूरे सेल अर्क लाभ क्योंकि inhomogeneous समुच्चय कभी कभी दृश्य निरीक्षण द्वारा मनाया जा सकता है: आम तौर परनिकासी की स्थिति में कम नमक का उपयोग कर (100-300 मिमी) और गैर ईओण डिटर्जेंट (0.1-1% वी / वी) सांद्रता के लिए उदार। क्योंकि हमने देखा है कि इन समुच्चय की उपस्थिति उपज और / या बाद के संबंध कब्जा की गुणवत्ता को कम कर सकते हैं, हम नियमित रूप से उन्हें तितर-बितर करने के लिए (यहां तक कि जब वे नग्न आंखों से नहीं मनाया जाता है) sonication को लागू करने। समुच्चय समुच्चयित झिल्ली टुकड़े, पहले से milled खमीर कोशिकाओं 58 से निष्कर्षों की रिपोर्ट में उन लोगों के बराबर के साथ संगत कर रहे हैं। Sonication भी डीएनए कतरनी और समाधान में chromatin टुकड़े आजाद कराने के लिए कुछ प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है, हालांकि sonication की डिग्री इस प्रोटोकॉल में लागू appreciably टुकड़ा डीएनए नहीं करता है। सीमित उपलब्धता (या उच्च लागत) एक उत्कृष्ट समानता ligand या ब्याज की विशेष प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का एक और बाधा हो सकती है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध समानता अभिकर्मकों की एक विस्तृत सरणी का उपयोग किया जा सकता है जब मॉडल जीव जीनोमिक टैगिंग या टीआर के लिए उत्तरदायी हैअस्थानिक अभिव्यक्ति वैक्टर, आत्मीयता टैग fusions के रूप में ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति की अनुमति देने के साथ ansfection। हालांकि, कस्टम एंटीबॉडी के उत्पादन में तेजी से संभव हो गया है और दोनों पॉलीक्लोनल और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी संबंध कब्जा अनुप्रयोगों में उत्कृष्ट प्रदर्शन कर सकते हैं। ये कई कारणों से भी संदर्भ 1 में अधिक से अधिक विस्तार में शामिल किया जाता है।
कैसे सेल विधि और आत्मीयता के माध्यम के चुनाव परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं के उदाहरण चित्रा 1 में सचित्र हैं। अलग extractants द्वारा लगाए गए प्रभाव के उदाहरण संदर्भों 1,11,24 में देखा जा सकता है। क्योंकि इन और अन्य प्रयोगात्मक मापदंडों संबंध कब्जा की गुणवत्ता को प्रभावित यह मुश्किल एफपीएस भेदभाव करने के लिए कर रही है, "मनका proteomes" और कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण के खजाने को खत्म करने की गैर विशिष्ट contaminants एफपीएस 40-43 की पहचान करने में सहायता करने के लिए विकसित किया गया है। फिर भी, इस तरह के दृष्टिकोण केवल substitएक सीमित डिग्री करने के लिए 59 इष्टतम नमूना तैयार करने के लिए संस्थान। सर्वोत्तम प्रथाओं के अवलोकन और अनुभव से अनुकूलन के संबंध कब्जा प्रयोग बहाव के विश्लेषण के लिए उच्चतम गुणवत्ता के नमूने प्रदान करेगा, आगे नीचे चर्चा की। एक आसानी से लागू अभ्यास है कि नमूना पवित्रता सुधार कर सकते हैं मूल निवासी क्षालन है। मूल निवासी क्षालन सबसे अक्सर समानता पृथक प्रोटीन जटिल, अक्षत, आगे प्रयोग के लिए प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है; लेकिन के रूप में यह अक्सर नमूना पवित्रता को बढ़ाता है, यह भी इस कारण अकेले के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, के रूप में चित्रा 1, पैनल द्वितीय में प्रदर्शन, देशी क्षालन की क्षमता नमूना शुद्धता में सुधार करने के लिए सेल निकालने में लक्ष्य प्रोटीन की प्रचुरता के लिए आत्मीयता के माध्यम की मात्रा का एक सटीक अनुमापन पर निर्भर हो सकता है – मध्यम अधिक है जब , खाली paratopes एफपी प्रोटीन natively eluted भागों में नमूदार के बंद लक्ष्य संचय अनुमति दे सकता है। अभिकर्मकों और यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं का उपयोग करना, यह जहमारा अनुभव रहा है कि के रूप में हमारे प्रयोगों के लिए एफपीएस के लिए सबसे बड़ा एकल योगदान टैग प्रोटीन ही एक बार जीवित कोशिका के संदर्भ से हटा दिया है। (छवि। 1.II और अंजीर। एस 1)। ऐसे मामलों में, माता पिता का नियंत्रण सेल लाइन है कि प्रतिजन के अभाव में अप्रासंगिक proteomes उपज कोई व्यावहारिक मूल्य के हैं; वैसे ही-ही टैग या कील में नियंत्रण है कि कुछ भी लेकिन लक्ष्य प्रतिजन से रहित हैं के लिए। इसलिए, जब भी हम व्यावहारिक मैं गंदगी 7,38, जो सीधे पोस्ट-सेल प्रोटीन मात्रात्मक एमएस का उपयोग कर बातचीत के संचय के उपायों को लागू। जैसा कि प्रोटोकॉल के चरण 3.2.7 में उल्लेख किया है, देशी क्षालन के लिए प्रक्रियाओं आत्मीयता के इस्तेमाल प्रणाली के विवरण के साथ अलग अलग होंगे। मूल निवासी क्षालन सबसे अधिक टैग की टैग प्रोटीन जटिल या प्रोटिओलिटिक दरार की प्रतियोगी विस्थापन द्वारा हासिल की है, आत्मीयता के माध्यम से जटिल जारी है। कई आकर्षण सिस्टम छोटे मिलान टैग के शामिल मौजूद हैं, के लिएआर मिलान में ही पेप्टाइड टैग प्रोटीन परिसरों 60 के प्रतिस्पर्धी क्षालन के लिए उपयोगी के रूप में उपलब्ध है। इसी तरह, कई proteases टैग विशेष रूप से आत्मीय साइटों रणनीतिक समानता में रखा फोड़ना के लिए उपलब्ध हैं संलयन प्रोटीन 61। चुने हुए समानता सिस्टम की बारीकियों पर निर्भर करता है, उचित क्षालन योजना को अपनाया जा सकता है।
आम तौर पर, प्राप्त परिणामों की गुणवत्ता में काफी नमूना तैयार की गुणवत्ता से प्रभावित हो जाएगा। यह जबकि देखभाल और परिशुद्धता बनाए रखने इन प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण के माध्यम से ध्यान से और ठीक से काम करने के लिए, और के रूप में तेजी से संभव के रूप में महत्वपूर्ण है। यह प्रत्येक चरण के माध्यम से ब्याज की प्रोटीन के विभाजन को ट्रैक करने के लिए प्रत्येक में गड़बड़ी की दक्षता को समझने की सलाह दी जाती है। उदाहरण के लिए: सेल या प्रश्न में ऊतकों में ब्याज की प्रोटीन प्रचुर मात्रा में कैसे है? शायद अध्ययन (और उसके परिसरों) के तहत प्रोटीन जन द्वारा चिह्नित करने के लिए चुनौतीपूर्ण होगाकम बहुतायत के कारण स्पेक्ट्रोमेट्री। शुद्ध परिसरों सामान्य प्रोटीन धुंधला (लगभग रेंज nanograms) द्वारा detectable हैं, मास स्पेक्ट्रोमेट्री सफल होने की संभावना है। ब्याज की कब्जा कर लिया प्रोटीन केवल संवेदनशील बढ़ाया chemiluminescent पश्चिमी सोख्ता (लगभग picogram रेंज) द्वारा पता लगाया जा सकता है, तो मास स्पेक्ट्रोमेट्री कम प्रभावी होने की संभावना है। यहां तक कि अगर ब्याज की प्रोटीन कोशिका में प्रचुर मात्रा में है, कैसे प्रचुर मात्रा में उत्पादन सेल निकालने में यह क्या है? समाधान के लिए प्रोटीन विभाजन करता है या यह गोली में है? यदि बाद, एक नया निष्कर्षण समाधान तैयार किया जा सकता है कि वसूली में सुधार हो सकता। एक बार सेल निकालने आत्मीयता के माध्यम के साथ संयुक्त है, कैसे प्रभावी ढंग से प्रोटीन कब्जा कर लिया है? प्रोटीन बाद washes के माध्यम से बंधे रहना पड़ता है? क्या अन्य copurifying प्रोटीन के बारे में? प्रोटोकॉल के लिए उचित कदम पर प्रत्येक नमूने की एक विभाज्य बचत करके इन सवालों को आसानी से पश्चिमी सोख्ता से उत्तर दिया जा सकता है, आम तौर पर ब्याज की प्रोटीन के खिलाफया सामान्य प्रोटीन धुंधला है, लेकिन अन्य assays भी उपयुक्त हो सकता है। हर कदम का अनुकूलन, उपज और कब्जा कर लिया परिसरों की शुद्धता को बढ़ाने हालांकि हो सकता है वहाँ एक व्यापार बंद एक विशेषता या अन्य को अधिकतम करने में किए जाने के लिए होगा।
कई शोधकर्ताओं के लिए संबंध कब्जा का एक विशिष्ट आवेदन ब्याज की प्रोटीन की एक छोटी संख्या के लिए विवो interactors में उम्मीदवार की पहचान है; इन उम्मीदवारों में आमतौर पर शारीरिक interactors की जैविक महत्व को प्रदर्शित करने के विवो में ओर्थोगोनल दृष्टिकोण द्वारा सत्यापन के अधीन हैं। संबंध कब्जा भी उच्च throughput अध्ययन से कार्यरत है, एक (लगभग) proteome व्यापक आधार पर मनाया प्रोटीन copurifying विवो परिसरों में ख्यात विषय में कम्प्यूटेशनल अनुमान की सुविधा की सूची उत्पन्न करने के लिए। इस तरह के अध्ययन के कई उदाहरण साहित्य में पाया जा सकता है। इस दृष्टिकोण की खोज के आदमी के पक्ष में किसी भी लक्ष्य के लिए कब्जा की शर्तों के अनुकूलन foregoesY लक्ष्य; इस तरह, अनुमानित परिसरों के रूप में खुद को शायद ही कभी पूरी तरह से बरकरार है और किसी भी नमूने में अत्यधिक शुद्ध प्राप्त कर रहे हैं। दरअसल, कई अलग आकर्षण कब्जा कर लिया नमूनों के बीच मनाया रचनाओं में आंशिक ओवरलैप अनुमान 42 का एक आधार के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। दोनों दृष्टिकोण interactome के बारे में हमारी समझ के लिए मूल्यवान डेटा योगदान करते हैं। फिर भी, संबंध कब्जा से एक बड़ा लाभ यह है कि यह अक्सर परिसरों बरकरार है और उच्च शुद्ध है, बशर्ते कि प्रयासों प्रक्रिया अनुकूलन करने के लिए बना रहे हैं प्राप्त करने का अवसर प्रदान करता है। हम मानते हैं कि दृष्टिकोण के भविष्य के शारीरिक interactors और आगे बहाव के जैव रासायनिक, enzymological में अधिक लगातार उपयोग करते हैं, और संरचनात्मक अध्ययन के सरगम की अधिक सटीक आकलन के लिए आसानी और अंतर्जात प्रोटीन परिसरों 11 का कब्जा अनुकूलन की क्षमता, बढ़ाने में निहित है, उदाहरण के लिए, संदर्भ 7,9,23।
The authors have nothing to disclose.
हम अपने अमूल्य सलाह, समर्थन, और एमएस इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए पहुँच है, साथ ही सुश्री केली आर Molloy के लिए प्रोफेसर ब्रायन टी Chait धन्यवाद। हम कॉपी संपादन के साथ समर्थन के लिए सुश्री केली नंगे धन्यवाद। यह काम एनआईएच अनुदान P41GM109824, P41GM103314, और P50GM107632 द्वारा समर्थित किया गया था।
Growth media & cell culturing implements | For producing frozen cells (I) | ||
500 cm^2 culture dishes | Corning | 431110 | For producing frozen cells (I) |
Large beaker (1-2L) | For producing frozen cells (I) | ||
Rectangular ice pan | Fisher Scientific | 13-900-747 | For producing frozen cells (I), & cryomilling (II) |
Phosphate buffered saline (PBS) | For producing frozen cells (I) | ||
Large cell scrapers | Fisher Scientific | 08-100-242 | For producing frozen cells (I) |
Liquid nitrogen | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
50 ml conical tubes | Corning | 352098 | For producing frozen cells (I), & cryomilling (II) |
20 ml Luer lock syringe | For producing frozen cells (I) | ||
Leur lock syringe caps | www.dymax.com | T11182 | For producing frozen cells (I) |
Refrigerated centrifuge | For producing frozen cells (I) | ||
50 ml tube rack, 4 position | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
Styrofoam box | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
Planetary ball mill, PM 100 | Retsch | 20.540.0001 | For cryomilling (II) |
Stainless steel milling jar, 50 ml | Retsch | 01.462.0149 | For cryomilling (II) |
Stainless steel milling balls, 20 mm Ø | Retsch | 05.368.0062 | For cryomilling (II) |
Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm | www.marcorubber.com | T1044-2.62×44.63 | For cryomilling (II) |
mini-LN2 decanter | homemade | see Ref 19 | For cryomilling (II) |
250 ml PTFE jar insulator (optional) | Retsch | custom order | For cryomilling (II) |
PTFE puck insulator (optional) | homemade | The Rockefeller University | For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request. |
5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional) | http://www.leeimh.com/ | 558 series check valve | For cryomilling (II) |
1.5 – 2 ml microfuge tubes | For affinity capture (III) | ||
Extractant | For affinity capture (III) | ||
cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Applied Science | 11873580001 | For affinity capture (III) |
Vortex mixer | For affinity capture (III) | ||
Ice bucket | For affinity capture (III) | ||
Microtip sonicator, Q700 | Qsonica | Q700 | For affinity capture (III) |
low intensity 1/16” microtip probe | Qsonica | 4717 | For affinity capture (III) |
Bench-top refrigerated microcentrifuge | For affinity capture (III) | ||
Dynabeads M-270 Epoxy | Thermo Fisher | 14302D | For affinity capture (III) |
Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads | homemade | For affinity capture (III); see reference 19 | |
Sample rotator | For affinity capture (III) | ||
Neodymium magnet | Life Technologies | 123-21D | For affinity capture (III) |
SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent) | For affinity capture (III) | ||
DTT | For affinity capture (III) | ||
SDS-PAGE system | For affinity capture (III) | ||
SDS-polyacrylamide gel | For affinity capture (III) | ||
Protein Stain | For affinity capture (III) |