Her beskriver vi protokoller for å forstyrre pattedyrceller av solid-state fresing ved en kryogenisk temperatur, produserer en celle ekstrakt fra den resulterende celle pulver, og isolere protein komplekser av interesse ved affinitet fangst på antistoff kombinert mikron-skala paramagnetiske kuler.
Affinity fangst er en effektiv teknikk for å isolere endogene protein komplekser for videre studier. Når den brukes i forbindelse med et antistoff, blir denne teknikken også ofte referert til som immunutfelling. Affinitet fangst kan brukes i en benk-skala og i en high-throughput sammenheng. Når kombinert med protein massespektrometri har affinitet fangst vist seg å være en arbeidshest av interactome analyse. Selv om det er potensielt mange måter å utføre de mange trinnene som er involvert, følgende protokoller gjennomføre våre favoriserte metoder. To egenskaper er karakteristiske: bruk av cryomilled celle pulver for å fremstille celle-ekstrakter, og antistoff-koplet paramagnetiske kuler som affiniteten medium. I mange tilfeller har vi fått bedre resultater som ble oppnådd med mer konvensjonelle affinitet fangst praksis. Cryomilling unngår mange problemer forbundet med andre former for celle brekkasje. Den gir effektiv knusing av materialet, og samtidig unngå denatrasjonsside problemstillinger knyttet til oppvarming eller skumming. Det beholder den opprinnelige proteinkonsentrasjonen opp til det punktet av utvinning, formildende macromolecular dissosiasjon. Det reduserer tiden ekstrahert proteiner tilbringer i oppløsning, noe som begrenser skadelige enzymatiske aktiviteter, og det kan redusere den ikke-spesifikke adsorpsjon av proteiner ved affinitets-medium. Micron stilt magnetisk affinitet medier har blitt mer vanlig de siste årene i økende grad erstatte den tradisjonelle agarose- og Sepharose-baserte medier. Viktigste fordelene med magnetiske medier omfatter vanligvis lavere ikke-spesifikt protein adsorpsjon; no størrelseseksklusjonsgrense fordi proteinkompleks binding oppstår på perleoverflaten i stedet for i porene; og enkel manipulasjon og håndtering ved hjelp av magneter.
En typisk anvendelse av de fremlagte fremgangsmåter er for å stabilisere og oppnå et høyt utbytte og renhet av endogene proteinkomplekser av interesse for interactomic karakterisering 1. Det skal forstås at dynamiske nettverk av både stabil og transient tilhørende makromolekylære komplekser, hovedsakelig består av proteiner, organisere cellulære prosesser 2,3. Mens det er mange eksperimentelle tilnærminger for å identifisere protein-protein-interaksjoner er affiniteten fange blant de mest brukte metoder for isolering og dissekere fysiologiske proteinkomplekser 4-6. Videre har denne teknikken den fordelen gir de makromolekylære komplekser som fysiske enheter, ikke bare som datapunktene i en lese-out; Fordelaktig kan de oppnådde komplekser således anvendes i en mengde av ytterligere nedstrøms biokjemiske, enzymatisk, og strukturelle analyser 7-9. De presenterte protokoller har blitt utviklet som svar på behovet for å kartlegge Proteinkonn-protein interaksjonsnettverk og karaktermakromolekylære komplekser i sine roller som de effektor molekyler av cellebiologi. De er detaljert med hensyn til deres anvendelse i pattedyrceller dyrket i vevskultur, men er like anvendelig for et bredt spekter av biologiske prøver som er gitt passende systemspesifikke tilpasninger.
Historien om affinitet fangst strekker seg tilbake til begynnelsen av det tjuende århundre med de første immunoaffinitetskromatografi eksperimenter – likner det som oftest referert til i dag som immunoprecipitation (IP) – vises i litteraturen av de tidlige 1950-tallet. Mainstream bruk av teknikken utvikles videre gjennom svingen av dette århundre til i dag 10-13. Diverse celle og molekylærbiologiske studier har benyttet mekanisk brudd av cellene ved fresing ved kryogeniske temperaturer for minst de siste førti år 14-19; og molekylære separasjoner utnytte (super) paramagnetiske kuler har become stadig vanligere i løpet av de siste to tiårene 20. Ved å kombinere disse ulike teknologiene har bidratt til å synergistisk forbedre resultatene som kan oppnås i proteinkompleks affinitet fangst eksperimenter 1, noe som gjenspeiles av en omfattende mengde arbeid produsert av oss selv og bredere fagmiljø 7,9,11,18,19,21 -23. Hjelpemiddel Resultatene er presentert i figur 1.
En samling av begrensninger og hensyn som gjelder for gjennomføring av effektive affinitet fangst eksperimenter kan bli funnet i referanse 1. Vanligvis denne tilnærmingen er mest hensiktsmessig å: (I) katalogisere interactors av et protein av interesse, dvs. bruke protein massespektrometri (MS) for å identifisere hittil ukjente copurifying proteiner (utforskende analyse); (II) analyse med hensyn på tilstedeværelsen av en spesiell samvirkende partner, det vil si bruker MS eller western blot for å detektere et bestemt protein eller begrenset sett av proteiner mistenkes for å iteract med proteinet av interesse (hypotesetesting); eller (III) utarbeide endogent samlet protein komplekser som inneholder protein av interesse for videre studier ved flere teknikker (preparativ opparbeiding). Før tar fatt på en affinitet fangst eksperimentelt regime er det absolutt nødvendig å ha en høy kvalitet affinitet reagens som binder seg til mål-protein, typisk en IP-kompetent antistoff mot det native målet protein av interesse eller mot et merke festet til et fusjonsprotein. Det er også viktig å ha egnede metoder for eksperimentell avlesning på plass: generelle protein-farging (som Coomassie blue, Sypro Ruby, eller sølv, etter SDS-PAGE), western blotting, og protein MS er alle vanligvis brukes i forbindelse med affinitet fangst 1. De presenterte protokoller utnytte antistoff konjugert magnetiske kuler som affinitet medium. Selv om funksjonen av affiniteten mediet kan i utgangspunktet bli validert i tester som benytter få eksperimentelle parametrene,oppnå de beste resultatene hvert forsøk bør empirisk optimalisert 1,11,24. Protokollene blir separert i tre distinkte faser: (1) fremstilling av frosne cellemateriale; (2) celle brudd ved fastfase-fresing ved kryogen temperatur; og (3) protein utvinning og affinitet fangst ved bruk av antistoff-koblet paramagnetiske kuler.
Disse tre protokollene arbeide sammen for å (1) forberede celler for solid-state brudd av cryomilling, (2) oppnå brudd i en planet ball mill, og (3) produsere uttrekk fra celle pulver til interesse fange et protein av interesse i kompleks med dets fysiologiske interactors. Mange forskjellige cellelyse teknikker eksisterer, inkludert mekaniske / fysiske tilnærminger ansette knusing innvirkning, klipping, og / eller trykk, samt kjemiske / enzymatiske metoder, hver med ulike fordeler og ulemper 49,50. Hver etterforsker oppfordres til å utforske metoder som passer best for sine analyser, men husk at en valgt tilnærming for celle brudd og protein utvinning er sannsynlig å introdusere skjevheter 51,52 nødvendig empirisk optimalisering (omtalt nedenfor). Mekaniske metoder kan produsere høy varme og / eller skjærkrefter som kan forstyrre protein komplekser. Cryomilling unngår varmeeffekter på grunn av anvendelse av LN 2 nedkjøling av prøver for than varigheten av prosessen. Planetkulemøller er forstått å stole på støt- og friksjonskrefter, blant annet skjærspenning, som komponenter i partikkelstørrelsesreduksjon 53,54. På innstillingene rapporterte vi har ikke observert degenerasjon av protein komplekser. Faktisk har vi trukket ut og hentet tilsynelatende intakte ~ 50 MDA atom pore komplekser 11 og enzymatisk aktive retrotransposons stiller høyere spesifikk aktivitet enn preparater som syssels 'milde' vaskemiddel-baserte lyse syv. Kjemiske / enzymatiske fremgangsmåter for cellelysering beheftet med den begrensning at innholdet i cellen blir sluppet ut i en in vitro miljø som støtter ødeleggelse av cellemembraner og strukturelle makromolekyler, men kan ikke være egnet for opprettholdelse av integriteten til proteinkomplekset (es ) av interesse. Ofte, hverken bestanddelene av kompleksene dannet med protein av interesse eller de betingelser som er nødvendig for å stabilisere målet komplekser erkjent på forhånd. En stor fordel med solid-state fresing er at brudd og utvinning er frakoblet, tillater kildematerialet for å være forberedt uten tilsatt væske, lagret (ved -80 ° C eller lavere), samlet, og praktisk hentet for on-demand eksperimentering; for eksempel, for å utforske optimalisert in vitro betingelser for affinitet fangst. Protein interaksjoner er mest stabile ved høy konsentrasjon 55,56, derfor minimere volumet av ekstraksjonsmidlet kan være fordelaktig for å bevare fysiologiske interaksjoner. På den annen side er det praktiske hensyn – til proteinkomplekser trenger å bli fordelt ut av cellene og inn i en ikke-viskøs vandig fase, fri for uoppløselige aggregater, for å blande målet komplekser med affinitet medium. Videre er noen standardisering og kontroll over den in vitro miljø (pH, saltkonsentrasjon, etc.) som er nødvendig for systematisering og reproduserbarhet. Vi finner at ekstrakter produced i fortynningen området 1: 4-1: 9 (w: v) tilfredsstiller praktiske og teoretiske hensyn, noe som ga bedre resultater. I tillegg er den optimale andel av celleekstrakt til interessemellom må bestemmes. Dette gjøres empirisk ved titrering av ekstraktene med varierende mengder av affinitet medium og kan ha påvisbar virkning på signal-til-støy-forholdet av eksperimentet, nærmere diskutert nedenfor. En utmerket uttømming av målproteinet er typisk ≥70% av den løselige fraksjon av målproteinet, men> 90% er ønskelig, og kan være oppnåelige med forsiktig parameterisering av ekstraksjonsbetingelser. Mange slike praktiske hensyn er dekket i referanse 1. Paramagnetiske kuler er manipulert ved hjelp av neodymmagneter i et spesialisert mikrosentrifugerør holder, selv om hjemmelagde alternativer er levedyktig. Når de plasseres i holderen, perler samle seg på siden av røret under påvirkning av det magnetiske felt. Oppløsninger kan deretter fjernes uten disturbing perlene.
En begrensning av den presenterte cryomilling protokollen, utviklet med planetkulemølle som brukes her (se tabell of Materials), er at et minimum av materiale som er nødvendig for effektivt å mølle og gjenopprette celle pulver ved hjelp av denne anordning (> 1 g). Slike mengder kan lett oppnås med mange mikroorganismer, cellelinjer, og modellorganismer, og kan også ofte oppnås med vev skåret ut fra forsøksdyr. Imidlertid kan visse cellelinjer være meget vanskelig å vokse i overflod og animalsk vev kan være mangelvare. Mindre mengder av materialet kan forhold malt ved hjelp av andre enheter som bruker mindre beholdere, men potensielt på bekostning av pulveret finhet oppnådd. I tillegg kan kostnaden av mekaniske anordninger frese være uoverkommelig kostbart for noen laboratorier. Cryomilling kan oppnås ved hjelp av en rekke alternative oppsett 14-19, inkludert de fleste rimelig for hånd med en pestle og mørtel, selv om brudd effektivitet synker betraktelig. Affinity fange protokoller vanligvis tar sikte på en høy virkningsgrad av cellelysering for å lette maksimal proteinekstraksjon i oppløsning og dermed maksimal potensial for fangst av mål-proteinkomplekser. På den annen side har det blitt demonstrert for gjær in vitro spleising ekstrakter at maksimal lysering ikke kan likestille med maksimal in vitro biokjemisk aktivitet 57,58. Vi har ikke observert slike problemer i systemene vi har testet så langt, og derfor ikke med vilje begrense vår celle brudd når cryomilling. Likevel bør denne muligheten tas i betraktning når du optimaliserer for in vitro enzymatiske analyser. Selv om cryomilling er en svært effektiv metode for å bryte cellene, en begrenset mengde av ultralydbehandling ofte fordeler produksjons homogene hele celleekstrakter fra pattedyrvev fordi inhomogene aggregater kan noen ganger observeres ved visuell kontroll: vanligvisi ekstraksjonsbetingelsene ved bruk av lav til moderat salt (100-300 mM) og ikke-ionisk detergent (0,1-1% v / v) konsentrasjon. Fordi vi observert at tilstedeværelsen av disse aggregater kan redusere utbyttet og / eller kvaliteten av den etterfølgende affinitet fangst, vi rutinemessig gjennomføre ultralydbehandling for å dispergere dem (selv når de ikke er observert med det blotte øye). Aggregatene er i overensstemmelse med agglomererte membranfragmenter, kan sammenlignes med de som tidligere er rapportert i ekstrakter fra oppmalte gjærceller 58. Sonikering blir også brukt i noen protokoller for å skjære DNA, og frigjøre kromatin fragmenter i oppløsning, men graden av ultralydbehandling anvendt i denne protokollen ikke nevneverdig fragment DNA. Den begrensede tilgjengelighet (eller de høye kostnadene) av en utmerket affinitet ligand eller antistoff mot det bestemte protein av interesse kan være en annen hindring. Et bredt utvalg av kommersielt tilgjengelige tilhørighet reagenser kan utnyttes når modellorganisme er mottagelig for genomisk tagging eller transfection med ektopiske ekspresjonsvektorer, og som tillater ekspresjon av proteiner av interesse som affinitets-merket fusjoner. Imidlertid har produksjon av tilpassede antistoffer blitt stadig mer gjennomførbart og både polyklonale og monoklonale antistoffer kan utføre utmerket i affinitet fangst applikasjoner. Disse mange hensyn er også dekket i større detalj i referanse 1.
Eksempler på hvordan de cellelysemetoden og valg av affinitet medium kan påvirke resultatene er illustrert i figur 1. Eksempler på virkninger som utøves av forskjellige ekstraksjonsmidler kan ses i henvisningene 1,11,24. Fordi disse og andre eksperimentelle parametere påvirker kvaliteten på affinitet fangst, noe som gjør det vanskelig å skille FPS, til samlinger av "perle proteom" og beregningsorientert tilnærminger eliminere uspesifikke forurensninger har blitt utviklet for å bistå i å identifisere fps 40-43. Likevel, slike tilnærminger bare substitUte for optimal prøveopparbeidelse i begrenset grad 59. Observerer beste praksis og empirisk optimalisere affinitet fangst eksperimentet vil gi den høyeste kvalitet prøver for nedstrøms analyser, nærmere omtalt nedenfor. En enkelt implementeres praksis som kan forbedre prøve renhet er innfødt eluering. Native eluering blir oftest anvendt for å oppnå affiniteten isolerte proteinkomplekset, intakt, for ytterligere eksperimentering; men som det ofte forbedrer prøve renhet, det kan også brukes av denne grunn alene. Imidlertid, som vist i figur 1, panel II, kan evnen til naturlig eluering for å forbedre prøve renhet er avhengig av en nøyaktig titrering av mengden av affinitet medium til overflod av målproteinet i celleekstrakt – når mediet er i overskudd , ubebodde paratopes kan tillate off-target opphopning av FP proteiner observer i opprinnelig eluerte fraksjoner. Bruke reagenser og prosedyrer som er beskrevet her, det hsom er vår erfaring at den største bidragsyteren av FPS til våre eksperimenter er merket protein i seg selv en gang fjernet fra rammen av levende celle. (Fig. 1.II og S1 fig.). I slike tilfeller, foreldrecellelinje kontroll som gir irrelevante proteom i fravær av antigenet er av noen praktisk verdi; likeså for tag-bare eller pigg-kontroller som er blottet for alt annet enn målet antigen. Derfor, når praktisk vi implementere I-DIRT 7,38, som direkte måler akkumulering av post-lysis protein interaksjoner som bruker kvantitative MS. Som nevnt i trinn 3.2.7 i protokollen, vil prosedyrer for opprinnelig eluering varierer med detaljene i affinitet systemet som brukes. Native eluering er oftest oppnås ved konkurranse forskyvning av merket protein kompleks eller proteolytisk spalting av koden, frigjøre komplekset fra affinitet medium. Flere interesse systemer som består av små epitop koder finnes, for som epitopen i seg selv er tilgjengelig som peptid nyttig for konkurranse eluering av merket protein komplekser 60. Likeledes flere proteaser er tilgjengelige for å spesifikt spalte beslektede områder strategisk plassert i affinitet tagged fusjonsproteiner 61. Avhengig av detaljene i de valgte affinitet systemer, kan den aktuelle eluering ordningen vedtas.
Vanligvis, vil kvaliteten av de oppnådde resultater bli betydelig påvirket av kvaliteten av prøvepreparering. Det er viktig å arbeide nøyaktig og presist gjennom hvert trinn av disse protokollene, og så raskt som mulig, og samtidig opprettholde omhu og presisjon. Det er tilrådelig å spore oppdeling av proteinet av interesse gjennom hvert trinn for å forstå effektiviteten av hver manipulasjon. For eksempel: hvordan rikelig er proteinet av interesse i cellen eller vevet i spørsmålet? Kanskje proteinet under studie (og dets komplekser) vil være vanskelig å karakterisere masse-spektrometri grunn av lav overflod. Hvis de rensede komplekser kan påvises ved generell protein flekker (ca. nanogram range), er massespektrometri sannsynlig å lykkes. Dersom det innfangede proteinet av interesse bare kan påvises ved sensitive forbedret kjemiluminescerende western blotting (ca. pikogram område), er mindre sannsynlig å være effektive massespektrometri. Selv om proteinet av interesse er rikelig i cellen, hvor rik er det i cellen produserte ekstrakt? Gjør proteinet partisjonen til løsningen eller det er i pellet? Hvis det siste, kan en ny utvinning løsning utarbeides som kan øke utvinningen. Når celleekstrakt er kombinert med affinitet medium, hvor effektivt blir proteinet fanges? Har proteinet fortsatt være bundet gjennom Senere vaskes? Hva om andre copurifying proteiner? Ved å lagre en porsjon av hver prøve på hensiktsmessige trinnene i protokollen disse spørsmålene kan lett bli besvart, typisk ved western-blotting mot proteinet av interesseeller generell proteinfarging, men andre assays kan også være egnet. Optimalisering av hvert trinn vil forbedre utbyttet og renheten av fanget komplekser, selv om det kan være en avveining må gjøres i å maksimere en egenskap eller den andre.
En typisk anvendelse av affinitet fange for mange forskere er å identifisere kandidat in vivo interactors for et lite antall av proteiner av interesse; disse kandidatene blir ofte utsatt for validering av ortogonale tilnærminger in vivo for å demonstrere den biologiske betydningen av de fysiske interactors. Affinity fangst er også ansatt i high-throughput studier for å generere lister over copurifying proteiner observert på en (nesten) proteom- basis, tilrettelegging beregnings slutninger om antatte in vivo komplekser. Tallrike eksempler på slike undersøkelser kan finnes i litteraturen. Denne tilnærmingen avstår optimalisering av avtalene om fangst for en gitt mål i favør av å utforske manny mål; Som sådan, inferred komplekser selv er sjelden hentes fullt intakt og svært ren i en gitt prøve. Snarere er de delvis overlapper i komposisjoner observert mellom mange forskjellige affinitet-fanget prøvene brukt som grunnlag for slutninger 42. Begge tilnærmingene bidrar verdifulle data til vår forståelse av interactome. Likevel, en stor fordel med affinitet fangst er at det ikke tilbyr ofte mulighet til å få komplekser intakt og høyt renset, forutsatt at arbeidet er gjort for å optimalisere prosedyren. Vi tror at fremtiden for tilnærming ligger i å øke brukervennlighet og effektivitet for å optimalisere fangst av endogene protein komplekser 11, for mer nøyaktig vurdering av skalaen av fysiologiske interactors og hyppigere bruk i videre nedstrøms biokjemiske, enzymological og strukturelle studier, f.eks refererer 7,9,23.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker professor Brian T. Chait for hans uvurderlige råd, støtte og tilgang til MS instrumentering, samt Ms Kelly R. Molloy for god teknisk støtte. Vi takker Ms. Kelly Bare for støtte med kopi redigering. Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH tilskudd P41GM109824, P41GM103314, og P50GM107632.
Growth media & cell culturing implements | For producing frozen cells (I) | ||
500 cm^2 culture dishes | Corning | 431110 | For producing frozen cells (I) |
Large beaker (1-2L) | For producing frozen cells (I) | ||
Rectangular ice pan | Fisher Scientific | 13-900-747 | For producing frozen cells (I), & cryomilling (II) |
Phosphate buffered saline (PBS) | For producing frozen cells (I) | ||
Large cell scrapers | Fisher Scientific | 08-100-242 | For producing frozen cells (I) |
Liquid nitrogen | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
50 ml conical tubes | Corning | 352098 | For producing frozen cells (I), & cryomilling (II) |
20 ml Luer lock syringe | For producing frozen cells (I) | ||
Leur lock syringe caps | www.dymax.com | T11182 | For producing frozen cells (I) |
Refrigerated centrifuge | For producing frozen cells (I) | ||
50 ml tube rack, 4 position | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
Styrofoam box | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
Planetary ball mill, PM 100 | Retsch | 20.540.0001 | For cryomilling (II) |
Stainless steel milling jar, 50 ml | Retsch | 01.462.0149 | For cryomilling (II) |
Stainless steel milling balls, 20 mm Ø | Retsch | 05.368.0062 | For cryomilling (II) |
Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm | www.marcorubber.com | T1044-2.62×44.63 | For cryomilling (II) |
mini-LN2 decanter | homemade | see Ref 19 | For cryomilling (II) |
250 ml PTFE jar insulator (optional) | Retsch | custom order | For cryomilling (II) |
PTFE puck insulator (optional) | homemade | The Rockefeller University | For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request. |
5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional) | http://www.leeimh.com/ | 558 series check valve | For cryomilling (II) |
1.5 – 2 ml microfuge tubes | For affinity capture (III) | ||
Extractant | For affinity capture (III) | ||
cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Applied Science | 11873580001 | For affinity capture (III) |
Vortex mixer | For affinity capture (III) | ||
Ice bucket | For affinity capture (III) | ||
Microtip sonicator, Q700 | Qsonica | Q700 | For affinity capture (III) |
low intensity 1/16” microtip probe | Qsonica | 4717 | For affinity capture (III) |
Bench-top refrigerated microcentrifuge | For affinity capture (III) | ||
Dynabeads M-270 Epoxy | Thermo Fisher | 14302D | For affinity capture (III) |
Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads | homemade | For affinity capture (III); see reference 19 | |
Sample rotator | For affinity capture (III) | ||
Neodymium magnet | Life Technologies | 123-21D | For affinity capture (III) |
SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent) | For affinity capture (III) | ||
DTT | For affinity capture (III) | ||
SDS-PAGE system | For affinity capture (III) | ||
SDS-polyacrylamide gel | For affinity capture (III) | ||
Protein Stain | For affinity capture (III) |