Detecção da actividade de dependente do pH<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Jan-Ulrik Dahl; Philipp Koldewey; James C. A. Bardwell; Ursula Jakob

doi:10.3791/54527

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Artigo de método

Detecção da actividade de dependente do pH

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DOI:

10.3791/54527

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23 de outubro de 2016

Jan-Ulrik Dahl¹ , Philipp Koldewey¹^,² , James C. A. Bardwell¹^,² , Ursula Jakob¹

¹Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, ²Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

Neste artigo

Resumo

Este estudo descreve técnicas biofísicas, bioquímicos e moleculares que caracterizam a actividade acompanhante de Escherichia coli HdeB sob condições de pH ácido. Estes métodos têm sido aplicados com sucesso para outras chaperonas ácido-protectores, tais como HdeA e pode ser modificado para funcionar com os outros acompanhantes e condições de stress.

Resumo

As bactérias são freqüentemente expostos a mudanças ambientais, tais como alterações no pH, temperatura, estado redox, a exposição à luz ou força mecânica. Muitas destas condições causar proteína se desdobrar na célula e ter um impacto negativo sobre a sobrevivência do organismo. Um grupo de chaperonas moleculares independentes, específicos de stress têm sido mostrados para desempenhar papéis essenciais na sobrevivência destas condições de stress. Enquanto totalmente dobrado e acompanhante-inativo antes de stress, estas proteínas se desdobram rapidamente e se tornar acompanhante-ativa sob condições de estresse específicos. Uma vez activadas, estas chaperonas condicionalmente desordenados se ligam a um grande número de proteínas de agregação propensas diferentes, impedir a sua agregação e facilitar, quer directamente ou indirectamente, a proteína de redobragem após o regresso a condições não-tensão. A abordagem principal para ganhar uma compreensão mais detalhada sobre o mecanismo da sua activação e cliente reconhecimento envolve a purificação e subsequent caracterização dessas proteínas chaperonas utilizando ensaios in vitro. Follow-up em ensaios de estresse in vivo são absolutamente essenciais para confirmar independentemente o obtido resultados in vitro.

Este protocolo descreve in vitro e in vivo em métodos para caracterizar a actividade de chaperona E. coli HdeB, uma chaperona activadas por ácido. Medições de dispersão de luz foram utilizados como uma leitura conveniente limite para a capacidade de HdeB para prevenir a agregação induzida por ácido de uma proteína modelo estabelecido cliente, MDH, in vitro. experimentos ultracentrifugação analítica foram aplicados para revelar formação de complexos entre HdeB e sua LDH proteína cliente, para lançar luz sobre o destino de proteínas clientes após o seu regresso a condições não-estresse. ensaios de actividade enzimática das proteínas de cliente foram conduzidos para monitorizar os efeitos da inactivação HdeB no cliente induzida pelo pH e reactivação. Finalmente, os estudos de sobrevivência foram usadas para monitor a influência da função da chaperona HdeB in vivo.

Introdução

Um ambiente natural comum em que agentes patogénicos microbianos experimentar condições de desdobramento da proteína induzida por ácido do estômago de mamífero é (gama de pH 1-4), cujo pH ácido serve como uma barreira eficaz contra agentes patogénicos de origem alimentar ^1. Proteína se desdobrar e agregação, que é causada por protonação cadeia lateral de aminoácido, afecta os processos biológicos, danifica as estruturas celulares e, eventualmente, ^1,2 provoca a morte celular. Uma vez que o pH do periplasma bacteriano equilibra-se quase instantaneamente com o pH do ambiente devido à livre difusão de protões através da membrana exterior porosa, pr....