في فيفو نموذج لاختبار تأثير نقص الأكسجة على الانبثاث ورم
Summary
This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.
Abstract
Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm3. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.
Introduction
يوينغ ساركوما (ES) هي خباثة العدوانية التي تؤثر على الأطفال والمراهقين. 1 الأورام تنمو في الأنسجة الرخوة والعظام، عادة في الأطراف. في حين وجود نقائل هو أقوى عامل النذير سلبي واحد للمرضى وفاق، لا تزال الآليات الكامنة وراء تنميتها واضحة. 2 ورم نقص الأكسجة هو واحد من العوامل القليلة المتورطين في ES التقدم. في المرضى الذين فاق، ويرتبط وجود مناطق غير perfused داخل أنسجة الورم مع سوء أحوال الطقس. 3 في المختبر، نقص الأكسجين يزيد من غزو خلايا ES ويطلق تعبير عن الجينات الموالية للالنقيلي. 4-6 ومع ذلك، على الرغم من هذه الأسطر من الأدلة، لا يوجد دليل مباشر على وفاق الناجم عن نقص الأكسجة تطور وانتشار موجودا. وعلاوة على ذلك، فإن الآليات التي نقص الأكسجة يمارس هذه الآثار هي، في الوقت الحاضر، غير معروفة. ومن هنا، قمنا بإنشاء نموذج في الجسم الحي لملء الفجوة بين القائمة في بيانات المختبر وobser السريريالأرصاد. هذا النظام النموذجي تمكن من اختبار مباشر من آثار نقص الأكسجين على الأورام التي تحدث في بيئتها الطبيعية، وذلك باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) لمتابعة تطور الورم والانبثاث في الجسم الحي في تركيبة مع خارج الحي التحليلات المرضية والجزيئية (الشكل 1).
منذ لا يوجد نموذج المعدلة وراثيا المعمول بها ES متاح حاليا، فإن الدراسات المجراة على خصائص النقيلي من هذه الأورام تعتمد على حقن الخلايا البشرية في الفئران المناعة. في حين أن استخدام الحيوانات ضعف المناعة قد نقلل من تأثير على الجهاز المناعي على تطور المرض، والقدرة على استخدام الخلايا البشرية يزيد ترجمتها من هذه الدراسات. ومن بين النماذج طعم أجنبي المختلفة، والحقن النظامية إلى الوريد الذيل هي أسهل للأداء، ولكنها حذفت الخطوات الأولية من ورم الخلايا دخول الوعاء والهروب من الموقع الرئيسي للنمو. 7-12 من ناحية أخرى، orthoto الموافقة المسبقة عن علم xenografting، الذي ينطوي على حقن الخلايا السرطانية في العظام (عظم الفخذ، الضلع) أو العضلات، هو أكثر تحديا من الناحية الفنية، ولكن أيضا أكثر بيولوجيا ذات الصلة لسرطان البشري. 13-16 القتل الرحيم الحيوانات ومع ذلك، في الماضي، وارتفاع معدلات المراضة المرتبطة بالنمو السريع للأورام الأولية وكثيرا ما استلزم قبل تطور ورم خبيث. في هذه الدراسة، قمنا بتوظيف نموذج المحددة سابقا من حقن الخلايا في عضلة الساق تليها استئصال الورم الرئيسي مما أدى جنبا إلى جنب مع مراقبة الطولي للتطور المنتشر طريق التصوير بالرنين المغناطيسي. 17،18 مثل هذه الحقن في عضلة الساق على مقربة من الساق تسمح لنمو الورم في بيئتين ES الطبيعية – العضلات والعظام – وينتج عن النقائل البعيدة إلى الأماكن المتضررة عادة في البشر. 18 وبالتالي، فإن هذا النموذج يلخص بدقة العمليات النقيلي التي تحدث في المرضى الذين يعانون ES أثناء تطور المرض.
خيمة "> توطين الأورام الأولية في hindlimb أقل كما يسهل مراقبة دقيقة من وصول الدم إلى الأنسجة السرطانية. ربط الشريان الفخذي (فال) هي تقنية راسخة المستخدمة في البحوث الأوعية الدموية لمنع تدفق الدم إلى المناطق البعيدة المحطة والتحقيق في الأوعية الدموية الأنسجة استجابة لنقص التروية. 19،20 الأهم من ذلك، ويتبع الانخفاض الأولي في تدفق الدم عن طريق فتح السفينة الجانبية وضخه الأنسجة لوحظ بعد حوالي 3 أيام فال. 20 وهكذا، عندما أجريت في أحد أطرافه الورم الحاملة، هذا النموذج بإعادة الأحداث نقص الأكسجة / ضخه التي تحدث بشكل طبيعي في الأورام التي تنمو بسرعة وتمكن من الهروب من خلايا الورم النقيلي بسبب إعادة التروية إلى انخفاض hindlimb عبر السفن الضمانات الذي افتتح حديثا. 21 والأهم من ذلك يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء عندما يكون حجم الورم صغيرة بما يكفي لمنع نقص الأكسجين الزائد في الأورام التحكم (عادة في الساق المجلد الورم الحاملةأوميا من 150-250 مم 3)، وضمان اختلافات كبيرة في مستويات نقص الأكسجة الورم بين السيطرة والمجموعات المعالجة فال.بالإضافة إلى مراقبة الطولي للتأثير نقص الأكسجين على وفاق الكمون وتيرة الانبثاث، وهذا النموذج يسمح أيضا لجمع الأنسجة وتطوير خطوط الخلايا الجديدة من كل من الأورام الابتدائية والانبثاث. الأهم من ذلك، العمل السابق نص على أن خطوط الخلايا المشتقة الانبثاث، معرضا تعزيز إمكانات المنتشر على إعادتها إلى الحيوانات، مشيرا إلى أن نشر ورم يرتبط مع تغييرات دائمة في الخلية النمط الظاهري الورم، وبالتالي التحقق من صحة استخدام هذه خطوط الخلايا فك العمليات النقيلي. 18 مجتمعة، وهذه النماذج يمكن الآن أن تستخدم في التحليلات الوراثية والجزيئية اللازمة لتحديد مسارات المنتشر الناجم عن نقص الأكسجين.
كما نقص الأكسجين هو أحد العوامل المؤيدة للالمنتشر تعزيز الورم الخبيث من مختلف رumors، لدينا نموذج يمكن أن تستخدم كمنصة للتحقيق في دور نقص الأكسجة في أنواع الأورام الأخرى التي تتطور بشكل طبيعي في أطرافه، مثل عظمية والعضلية المخططة. 21-23 وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق نهج مماثل لالأورام الخبيثة المتزايدة في مواقع تشريحية أخرى مع طريق واضحة المعالم من إمدادات الدم. في نهاية المطاف، فإن النموذج يمكن تعديل وفائدتها تمديدها، وهذا يتوقف على الاحتياجات البحثية الفردية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويشمل نموذجنا مقارنة ورم خبيث في مجموعتين تجريبيتين – مجموعة مراقبة، حيث يسمح للأورام لتطوير في hindlimb تليها البتر عند بلوغ حجم العجل 250 ملم 3، ومجموعة المعرضة للنقص الأكسجين، والذي tumor- يخضع تحمل hindlimb لفال في نفس الحجم، تليها بتر بعد 3 أيام. على الرغم من أن في هذه ا?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (NIH) grants: UL1TR000101 (previously UL1RR031975) through the Clinical and Translational Science Awards Program, 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 and 1R21CA198698 to JK. MRI was performed in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Preclinical Imaging Research Laboratory (PIRL) and tissue processing in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Histopathology & Tissue Shared Resource, both supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. The authors thank Dan Chalothorn and James E. Faber, Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, for their assistance with postmortem x-ray angiography, and providing insight and expertise on collaterogenesis.
Materials
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 mL Insulin syringes with permanently attached 28G½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges – Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 mL syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3 EDTA Micro tube 1.3ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
Referências
- Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
- Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
- Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
- Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing’s sarcoma cells in vitro. Pesquisa do Câncer. 70, 4015-4023 (2010).
- Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing’s sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372 (2010).
- Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
- Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
- Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Pesquisa do Câncer. 73, 967-977 (2012).
- Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor–specific inhibitor in Ewing’s sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
- Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing’s sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
- Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
- Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing’s sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
- Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128 (2014).
- Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
- Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing’s sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
- Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing’s sarcoma patients. Pesquisa do Câncer. 70, 7610-7619 (2010).
- Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing’s sarcoma. Pesquisa do Câncer. 64, 8349-8356 (2004).
- Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination – in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
- Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
- Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
- Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
- Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
- Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
- Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. . Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , (1988).
- Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
- Raymond, A. K., Lazar, A. J., PP, L. i. n., S, P. a. t. e. l. . Bone Sarcoma. , (2013).
- Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
- Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Pesquisa do Câncer. 36, 3761-3765 (1976).
