In vivo model voor het testen Effect van hypoxie op tumormetastase
Summary
This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.
Abstract
Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm3. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.
Introduction
Ewing-sarcoom (ES) is een agressieve maligniteit bij kinderen en adolescenten. 1 De tumoren in zachte weefsels en botten, gewoonlijk in de ledematen. Terwijl de aanwezigheid van metastasen is de meest krachtige prognostische factor voor ES patiënt, de onderliggende mechanismen hun ontwikkeling blijven onduidelijk. 2 Tumor hypoxie is een van de weinige factoren betrokken bij ES progressie. Bij ES patiënten, is de aanwezigheid van niet-geperfundeerde gebieden in het tumorweefsel geassocieerd met een slechte prognose. 3 In vitro verhoogt hypoxia invasiviteit van ES-cellen en triggers expressie van pro-metastatische genen. 4-6 Ondanks deze bewijslijnen, geen direct bewijs voor hypoxie geïnduceerde ES progressie en verspreiding bestaat. Bovendien, de mechanismen waarmee hypoxie uitoefent dergelijke effecten zijn momenteel onbekend. Daarom hebben we een in vivo model gemaakt om het gat te vullen tussen de bestaande in vitro data en klinische opmerkingen. Dit modelsysteem maakt direct testen van de effecten van hypoxie op tumoren die zich in hun natuurlijke omgeving, met behulp van magnetische resonantie beeldvorming (MRI) om tumorprogressie en metastase in vivo in combinatie met ex vivo pathologische en moleculaire analyses (figuur 1) te volgen.
Aangezien geen gevestigde transgeen model van ES is beschikbaar, de in vivo studies naar metastatische eigenschappen van deze tumoren afhankelijk injecties van menselijke cellen in immuungecompromitteerde muizen. Hoewel het gebruik van immunologisch verminderde dieren de effecten van het immuunsysteem het ziekteverloop kunnen onderschatten, het vermogen om menselijke cellen gebruiken verhoogt vertaalbaarheid van dergelijke studies. Tussen verschillende xenograft modellen, systemische injecties in de staartader zijn het makkelijkst uit te voeren, maar ze laat de eerste stappen van tumorcel intravasation en ontsnappen aan de primaire plaats van groei. 7-12 Anderzijds, orthoto pic xenografting, die injecties van tumorcellen omvat in bot (femur, rib) of spieren, is technisch uitdagend, maar ook biologisch menselijke kankerbestrijding. 13-16 In het verleden, de hoge morbiditeit geassocieerd met snelle groei van primaire tumoren vaak noodzakelijk euthanasie van dieren voor metastase ontwikkelen. In dit onderzoek gebruikten we een eerder vastgestelde model cel injecties in de gastrocnemiusspier gevolgd door excisie van de resulterende primaire tumor in combinatie met overlangse controle van metastatische progressie van MRI. 17,18 Dergelijke injecties in gastrocnemiusspier in de nabijheid van de tibia zorgen voor tumorgroei in twee natuurlijke milieus ES – spieren en botten – en leiden tot metastasen op afstand te plaatsen typisch getroffen mens. 18 Daardoor is dit model recapituleert nauwkeurig de metastatische processen in ES patiënten tijdens ziekteprogressie.
tent "> De lokalisatie van primaire tumoren bij de onderste achterbeen maakt ook de nauwkeurige regeling van de bloedtoevoer naar de tumor tissue. femorale slagader ligatie (FAL) is een gevestigde techniek gebruikt in angiogenese onderzoek bloedtoevoer naar distale gebieden van blokkeren het been en onderzoeken weefsel vascularisatie in reactie op ischemie. 19,20 Belangrijk is dat de initiële daling van de bloedstroom volgt collaterale tankopening en weefsel reperfusie geobserveerd ongeveer 3 dagen na FAL. 20 wanneer dus uitgevoerd in een tumordragende ledematen, dit model reproduceert hypoxie / reperfusie gebeurtenissen die van nature in snelgroeiende tumoren en maakt het ontsnappen van metastatische tumorcellen door herstel van de perfusie onderste achterbeen via nieuw geopende collaterale vaten. 21 Belangrijk is dat deze procedure moet worden uitgevoerd wanneer de tumorgrootte klein genoeg om buitensporige hypoxie controletumoren (typisch bij de tumordragende calf vol voorkomenume van 150-250 mm3) en zorgt voor aanzienlijke verschillen in tumorhypoxia tussen controle en FAL-behandelde groepen.Naast het longitudinaal volgen van het effect van hypoxia op ES latentie en de frequentie van metastasen, dit model maakt het ook voor het verzamelen van weefsel en de ontwikkeling van nieuwe cellijnen van zowel primaire tumoren en metastasen. Belangrijker eerdere werk vastgesteld dat-metastasen afgeleide cellijnen vertonen verbeterde metastatisch vermogen bij herintroductie dieren, wat aangeeft dat tumor verspreiding wordt geassocieerd met permanente veranderingen in de tumor cel fenotype, en waarbij het gebruik van deze cellijnen om de metastatische processen ontcijferen valideren. 18 Collectief kunnen deze modellen nu gebruikt worden voor de genetische en moleculaire analyses vereist voor het identificeren van hypoxie geïnduceerde metastatische trajecten.
Hypoxie is een pro-metastatische rol bij het versterken van de maligniteit van verschillende tumors, ons model kan worden gebruikt als een platform om de rol van hypoxie in andere tumortypen die van nature ontwikkelen ledematen, zoals osteosarcoom en rhabdomyosarcoom onderzoeken. 21-23 Bovendien kan dezelfde benadering worden toegepast maligniteiten groeien op andere anatomische locaties met een goed gedefinieerde route van bloedtoevoer. Uiteindelijk kan het model worden gemodificeerd en het nut verder uitgebreid, afhankelijk van de individuele behoeften aan onderzoek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ons model omvat de vergelijking van metastase in twee experimentele groepen – een controlegroep, waarbij tumoren kunnen ontwikkelen in de achterpoot, gevolgd door amputatie van een kalf volume van 250 mm3 bereiken en een hypoxie blootgestelde groep, waarbij de tumor lager achterbeen wordt onderworpen aan FAL hetzelfde volume, gevolgd door amputatie 3 dagen later. Hoewel in deze experimenten de FAL behandelde tumoren worden geamputeerd met enige vertraging ten opzichte van de controlegroep tumoren, is hun groo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (NIH) grants: UL1TR000101 (previously UL1RR031975) through the Clinical and Translational Science Awards Program, 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 and 1R21CA198698 to JK. MRI was performed in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Preclinical Imaging Research Laboratory (PIRL) and tissue processing in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Histopathology & Tissue Shared Resource, both supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. The authors thank Dan Chalothorn and James E. Faber, Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, for their assistance with postmortem x-ray angiography, and providing insight and expertise on collaterogenesis.
Materials
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 mL Insulin syringes with permanently attached 28G½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges – Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 mL syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3 EDTA Micro tube 1.3ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
Referências
- Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
- Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
- Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
- Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing’s sarcoma cells in vitro. Pesquisa do Câncer. 70, 4015-4023 (2010).
- Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing’s sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372 (2010).
- Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
- Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
- Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Pesquisa do Câncer. 73, 967-977 (2012).
- Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor–specific inhibitor in Ewing’s sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
- Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing’s sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
- Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
- Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing’s sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
- Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128 (2014).
- Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
- Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing’s sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
- Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing’s sarcoma patients. Pesquisa do Câncer. 70, 7610-7619 (2010).
- Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing’s sarcoma. Pesquisa do Câncer. 64, 8349-8356 (2004).
- Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination – in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
- Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
- Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
- Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
- Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
- Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
- Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. . Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , (1988).
- Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
- Raymond, A. K., Lazar, A. J., PP, L. i. n., S, P. a. t. e. l. . Bone Sarcoma. , (2013).
- Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
- Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Pesquisa do Câncer. 36, 3761-3765 (1976).
