Tümör metastaz üzerinde Hipoksi Test Etkisinin Vivo Modeli
Summary
This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.
Abstract
Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm3. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.
Introduction
Ewing sarkomu (ES) çocukları ve ergenleri etkileyen agresif bir kanseridir. 1 tümörler genellikle bacaklarda, yumuşak dokular ve kemikleri de gelişebilir. metastaz varlığı ES hastalar için tek ve en güçlü kötü prognostik faktör iken, onların gelişimini altında yatan mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. 2 tümör hipoksi ES ilerlemesinde rol birkaç faktörlerden biridir. ES hastalarda, tümör dokusu içinde perfüze olmayan alanlarının varlığı kötü prognoz ile ilişkilidir. 3 in vitro, hipoksi ES hücrelerinin invazivliğini artırır ve pro-metastatik genlerin ifade tetikler. 4-6 Bununla birlikte, kanıt bu satırları rağmen, hipoksi kaynaklı ES ilerlemesi ve yayılması için doğrudan kanıt var. Ayrıca, bilinmeyen hipoksi şu anda bu tür etkiler uygular hangi mekanizmalar. Dolayısıyla, biz in vitro verileri ve klinik glikozu mevcut arasındaki boşluğu doldurmak için bir in vivo model oluşturdukyenilikçiliklere. Bu model sistemi, ex vivo olarak, patolojik ve moleküler analizleri (Şekil 1) ile kombinasyon halinde, in vivo olarak tümör ilerlemesi ve metastaz takip manyetik rezonans görüntüleme (MRI) kullanılarak, doğal ortamında oluşan tümör üzerindeki hipoksiye doğrudan test sağlar.
ES yerleşik bir transgenik modeli mevcut olduğundan, bu tümörlerin metastatik özelliklerine in vivo çalışmalar immün sistemi baskılanmış farelere insan hücrelerinin enjeksiyonu güveniyor. immünolojik engelli hayvanların kullanımı hastalığın ilerlemesi üzerinde bağışıklık sisteminin etkisini hafife olsa da, insan hücrelerini kullanma yeteneği bu tür çalışmaların çevirilebilirlik artırır. Farklı ksenograft modelleri arasında, kuyruk damar içine sistemik enjeksiyonlar gerçekleştirmek için en kolay, henüz onlar tümör hücre intravazasyonunda ilk adımları ihmal ve büyümenin birincil sitesinden kaçmak. Öte yandan, 7-12, orthoto kemikler (femur, kaburga) ya da kas içine tümör hücrelerinin enjekte içeren pic Xenografting, biyolojik olarak daha insan kanser ile ilgili daha teknik açıdan zorlayıcı, ama aynı zamanda. Metastaz gelişmeden önce 13-16 Bununla birlikte, geçmişte, primer tümörlerin hızlı büyüme ile ilişkili yüksek morbidite genellikle gerekli kılmıştır hayvan ötenazi. Bu çalışmada, biz MRG ile metastatik ilerlemesi boyuna izlenmesi ile birlikte ortaya çıkan primer tümörün eksizyonu takiben gastroknemius kasının içine hücre enjeksiyonu, önceden belirlenmiş bir model kullandı. Kaslar ve kemikler – – tibia yakın gastroknemius kas içine 17,18 tür enjeksiyonlar iki doğal ES ortamlarında tümör büyümesi için izin ve tipik insanlarda etkilenen yerlere uzak metastaz ile sonuçlanır. 18 Böylece, bu model doğru hastalığın ilerlemesi sırasında ES hastalarda görülen metastatik süreçleri tartışıldı.
tert "> düşük hindlimb birincil tümörlerin lokalizasyonu, tümör dokusuna kan akımı hassas kontrolünü kolaylaştırır. femoral arter ligasyonu (FAL) uzak bölgelere kan akışını engellemek için anjiyojenez araştırmada kullanılan iyi bilinen bir tekniktir ayak ve iskemi tepki doku vaskülarizasyonu araştırılması. 19,20 Önemli olarak, kan akımının başlangıç damla yaklaşık olarak 3 gün FAL sonra gözlenen kollateral açma ve reperfüzyonun takip etmektedir. 20 Bu durumda, bir tümör taşıyan ekstremitede yapıldığında, Bu model, hızla büyüyen tümörlerde doğal olarak hipoksi / reperfüzyon olayları yeniden ve yeni açılan kollateral damarlar yoluyla alt hindlimb için perfüzyon restorasyon nedeniyle metastatik tümör hücrelerinin kaçmasını sağlar. 21 önemlisi, tümör boyutu olduğunda bu işlem yapılmalıdır tipik olarak tümör taşıyan buzağı VOL'de kontrol tümörlerinin aşırı hipoksi (önleyecek kadar küçükKontrol ve FAL tedavi edilen gruplar arasında, tümör hipoksi düzeylerinde anlamlı farklılıklar sağlanması 250 mm3), – 150 ume.ES süresi için hipoksi etki ve metastaz frekans uzunlamasına izlenmesine ek olarak, bu model, doku toplanması ve primer tümörler ve metastazlar, hem yeni hücre çizgilerinin geliştirilmesine izin verir. Önemli bir şekilde, önceki çalışma metastaz türetilmiş hücre çizgileri, tümör yayılması, tümör sürekli hücre fenotipinde değişiklikler ve böylece metastatik işlemleri deşifre bu hücre çizgilerinin kullanımını geçerli ile ilişkili olduğunu gösteren hayvanlara yeniden yerleştirilmesi sırasında gelişmiş metastatik potansiyelini gösteren karar vermişlerdir. 18. Toplu olarak, bu model artık hipoksi kaynaklı metastatik yollarının tanımlanması için gerekli olan genetik ve moleküler analiz için kullanılabilir.
hipoksi gibi çeşitli t malignite arttırıcı yanlısı metastatik faktördürumors, bizim model, osteosarkom ve rabdomyosarkomu doğal olarak bacaklarda geliştirmek diğer tümör türleri, hipoksi rolünü araştırmak için bir platform olarak kullanılabilir. 21-23 Ayrıca, benzer bir yaklaşım, kan akışının iyi tanımlanmış bir yol ile anatomik yerle artan maligniteleri de uygulanabilir. Sonuçta, model modifiye edilebilir ve onun yarar daha bireysel araştırma ihtiyaçlarına bağlı olarak, genişletilmiş.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bizim modelimiz iki deney gruplarında metastaz karşılaştırılmasını içerir – tümörler 250 mm 3 bir buzağı hacmine ulaşmıştır üzerine amputasyon ardından hindlimb geliştirmek için izin verilen bir kontrol grubu, ve bir hipoksi maruz grubu, hangi tümöre içinde taşıyan arka bacak 3 gün sonra amputasyon, ardından aynı hacimde FAL tabi tutulur. Kontrol tümörlerine kıyasla bu deneylerde FAL-tedavi edilen tümörler, küçük bir gecikme ile ampute olsa da, onların büyüklük ligasyo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (NIH) grants: UL1TR000101 (previously UL1RR031975) through the Clinical and Translational Science Awards Program, 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 and 1R21CA198698 to JK. MRI was performed in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Preclinical Imaging Research Laboratory (PIRL) and tissue processing in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Histopathology & Tissue Shared Resource, both supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. The authors thank Dan Chalothorn and James E. Faber, Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, for their assistance with postmortem x-ray angiography, and providing insight and expertise on collaterogenesis.
Materials
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 mL Insulin syringes with permanently attached 28G½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges – Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 mL syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3 EDTA Micro tube 1.3ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
Referências
- Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
- Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
- Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
- Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing’s sarcoma cells in vitro. Pesquisa do Câncer. 70, 4015-4023 (2010).
- Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing’s sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372 (2010).
- Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
- Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
- Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Pesquisa do Câncer. 73, 967-977 (2012).
- Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor–specific inhibitor in Ewing’s sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
- Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing’s sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
- Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
- Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing’s sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
- Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128 (2014).
- Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
- Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing’s sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
- Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing’s sarcoma patients. Pesquisa do Câncer. 70, 7610-7619 (2010).
- Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing’s sarcoma. Pesquisa do Câncer. 64, 8349-8356 (2004).
- Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination – in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
- Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
- Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
- Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
- Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
- Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
- Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. . Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , (1988).
- Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
- Raymond, A. K., Lazar, A. J., PP, L. i. n., S, P. a. t. e. l. . Bone Sarcoma. , (2013).
- Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
- Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Pesquisa do Câncer. 36, 3761-3765 (1976).
