एरोबिक बारीक कीचड़ से स्ट्रक्चरल कोशिकी Polymeric पदार्थों की निकासी
Summary
प्रोटोकॉल आदेश alginate की तरह बाह्य पॉलिमर (शराब) को निकालने के लिए एरोबिक में दानेदार कीचड़ solubilize के लिए एक पद्धति प्रदान करता है।
Abstract
To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na2CO3) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca2+). From the six extraction methods used, only the Na2CO3 extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca2+. The Ca2+-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.
Introduction
हाल के वर्षों में एरोबिक बारीक कीचड़ (AGS) प्रक्रिया एक लोकप्रिय जैविक अपशिष्ट जल उपचार प्रक्रिया, सफलतापूर्वक कई पूर्ण पैमाने पर अपशिष्ट जल उपचार संयंत्रों 1 में लागू हो गया है। पारंपरिक सक्रिय कीचड़ प्रक्रिया के विपरीत, में AGS की प्रक्रिया सूक्ष्मजीवों flocs 2 के बजाय कणिकाओं के रूप में। ये कणिकाओं, बेहतर settleability है उच्च कार्बनिक लोड हो रहा दरों को झेलने, और सक्रिय कीचड़ flocs 3 से विषाक्तता के लिए उच्च सहिष्णुता करने में सक्षम हैं।
Biofilms के विपरीत, AGS अनायास किसी भी वाहक सामग्री 4 की भागीदारी के बिना बनाई है। 6 – AGS में, biofilms में की तरह, सूक्ष्मजीवों अत्यधिक हाइड्रेटेड कोशिकी polymeric पदार्थों की एक महत्वपूर्ण राशि (ईपीएस) 5 एक हाइड्रोजेल मैट्रिक्स, जिसमें वे स्वयं स्थिर 4 कर रहे हैं के लिए फार्म का उत्पादन। ईपीएस एक जटिल मिश्रण, polysaccharides, प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड से मिलकर, (phosp हैंHo) लिपिड, humic पदार्थों और कुछ कहनेवाला पॉलिमर 5,7,8। ये polymeric पदार्थों इलेक्ट्रोस्टैटिक बलों, हाइड्रोजन बांड, आकर्षक आयनिक बलों और / या जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं, आदि 5 माध्यम से एक दूसरे के साथ बातचीत, एक घने और कॉम्पैक्ट तृतीयक नेटवर्क संरचना बनाने। ईपीएस में पॉलिमर जो हाइड्रोजेल 4,9 फार्म और तृतीयक नेटवर्क संरचना के गठन में योगदान करने में सक्षम हैं इस संबंध संरचनात्मक ईपीएस, कुल ईपीएस के एक सबसेट के रूप में माना जाता है में हैं।
ईपीएस रासायनिक संरचना और कणिकाओं 5 के भौतिक गुणों के लिए जिम्मेदार हैं। यह इसलिए प्रत्येक ईपीएस यौगिक के समारोह को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। 15 – विभिन्न दृष्टिकोणों ईपीएस 10 को निकालने के लिए लागू कर रहे हैं। हालांकि, उनके चरम जटिलता के कारण, यह लगभग असंभव एक ही विधि द्वारा सभी घटकों ईपीएस निकालने के लिए है। तिथि करने के लिए, वहाँ कोई "एक आकार फिट बैठता सभी" ईपीएस निकासी के लिए विधि है। 20 – निष्कर्षण विधि की पसंद न केवल कुल राशि, लेकिन यह भी बरामद पॉलिमर 13,16 की संरचना को प्रभावित करती है। कीचड़ के प्रकार और ब्याज विभिन्न तरीकों की ईपीएस के आधार पर आवश्यक हैं।
जेल के गठन पॉलिमर निकालने, उनके गुणों निस्र्पक और एक दूसरे के साथ और गैर-जेल के गठन ईपीएस के साथ उनकी बातचीत की जांच कर एरोबिक बारीक कीचड़ गठन में ईपीएस की भूमिका को प्रकट करने में मदद मिलेगी। इसके अलावा, जेल के गठन पॉलिमर भी औद्योगिक अनुप्रयोगों में उपयोगी biopolymers हैं। एक संभव आवेदन पहले से ही एक कोटिंग सामग्री के रूप में AGS से जेल के गठन पॉलिमर का उपयोग कागज 21 के पानी प्रतिरोध को बढ़ाने के द्वारा दिखाया गया था।
इसलिए, निकासी तरीकों, जेल के गठन ईपीएस के लिए विशिष्ट की जरूरत है। इस अध्ययन का उद्देश्य एक पद्धति AGS से जेल के गठन ईपीएस निकालने के लिए विकसित करना है। छह निकासी तरीकों 10 – 15,22, जो अक्सर साहित्य में उपयोग किया जाता है, AGS से ईपीएस निकालने के लिए चयन किया गया था। कुल राशि और निकाले ईपीएस की जेल के गठन संपत्ति प्रत्येक पद्धति के लिए की तुलना में थे।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल अनुभाग के लिए टिप्पणियां
ईपीएस / शराब की निकासी 50 मिलीलीटर की एक मात्रा और कणिकाओं के 3 जी के लिए वर्णित है। इन मूल्यों के दिशा-निर्देशों के रूप में इरादा कर रहे हैं। उच्च सांद्रता के साथ दाना एक्सट्रैक्शन निकाले ईपीएस की उपज में कमी कर सकते हैं। शराब की निकासी के दौरान तापमान 30 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रखा जाना चाहिए। समय को गर्म करने के मिश्रण के लिए आवश्यक (लगभग 5 मिनट) प्रोटोकॉल में शामिल है। इसके अलावा, निकासी प्रभावकारिता कुप्पी नीचे का व्यास के रूप में एक ही आकार के एक चुंबकीय हलचल पट्टी का उपयोग करके बढ़ाया है। यह अच्छा मिश्रण गुण और मिलिंग प्रभाव में परिणाम होगा, ईपीएस की निकासी को बढ़ावा देने।
प्रोटोकॉल अनुभाग में बाद में, टीएस और वी.एस. सभी एक्सट्रेक्शन की पैदावार (सतह पर तैरनेवाला कदम 1.1-1.6 में एकत्र) निर्धारित कर रहे हैं। डायलिसिस टीएस करने से पहले और माप वी.एस. प्रदर्शन किया जा एक्सट्रेक्शन के लिए प्रयुक्त रसायनों की उपस्थिति के कारण संभव त्रुटियों को कम करने की जरूरत है। ए3,500 दा की MWCO डायलिसिस बैग के भीतर ईपीएस अणुओं को बनाए रखना है, जबकि इन रसायनों को दूर करने के लिए सिफारिश की है। डायलिसिस बैग निकालने की मात्रा की तुलना में एक बड़ी मात्रा होनी चाहिए। यह आवश्यक है, क्योंकि निकालने की मात्रा (40% मात्रा बढ़ाने के लिए EDTA निकासी के लिए, उदाहरण के लिए) डायलिसिस के दौरान वृद्धि होगी। डायलिसिस द्वारा रासायनिक हटाने की हद से पहले और डायलिसिस के बाद नमूने में पीएच को मापने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, डायलिसिस पानी की चालकता माप आयन हटाने की हद तक दिखा।
कुल निकाले ईपीएस से शराब प्राप्त करने के लिए (कदम 1.6 और 2) डायलिसिस चरण वैकल्पिक है। फिर भी, डायलिसिस तीन फायदे हैं: यह कम कर देता है एचसीएल की राशि वर्षा के लिए की जरूरत है, इसे निकालने में एसिड बड़े पैमाने पर स्थानांतरण में सुधार और प्राप्त शराब की राख की मात्रा कम हो जाती है। शराब की वर्षा के लिए यह extrac से एक बहुत बड़ी मात्रा के साथ एक गिलास बीकर का उपयोग करने के लिए सिफारिश की हैटी। ना 2 3 सीओ सामान्य रूप से निकासी में overdosed है। जोड़ा एचसीएल पहले ना 2 3 सीओ के साथ प्रतिक्रिया होगी निकालने में छोड़ दिया, कार्बन डाइऑक्साइड के गठन में जिसके परिणामस्वरूप और, अगर नमूना पहले dialyzed नहीं किया गया था, झाग में। एचसीएल के अलावा दौरान निकालने बीकर के नीचे के रूप में एक ही आकार के एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ धीरे-धीरे उभारा जाना चाहिए। इस आकार और धीमी सरगर्मी की हलचल बार भी वेग की संरचना को तोड़ने के बिना मिश्रण का परिणाम देगा। अम्लीय जेल झुरमुटों निकालने में गठन कर रहे हैं, बीकर हाथ से थोड़ा swirled किया जाना चाहिए। वर्षा निकालने की एक बड़ी मात्रा में वृद्धि से बचने के लिए, जबकि अभी भी नमूने में एसिड का एक सजातीय वितरण प्राप्त करने के 1 मीटर की एक एसिड एकाग्रता के साथ आयोजित किया जाता है। उच्चतर एसिड सांद्रता एक क्षेत्रीय पीएच कमी और अम्लीय जेल झुरमुटों गठन में परिणाम कर सकते हैं। एक पीएच 2.0 से कम शायद संरचनात्मक परिवर्तन की वजह से, शराब की राशि है कि बरामद किया जा सकता कम हो जाती हैकम पीएच पर पॉलिमर की। यह 2.20 ± 0.05 पर अंतिम पीएच रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
सीमाओं
शराब निष्कर्षण विधि सामान्य में AGS या biofilms से ईपीएस के संरचनात्मक बाह्य पॉलिमर निकालने के लिए करना है और सभी उपस्थित ईपीएस निकालने के लिए इरादा नहीं है। सभी ईपीएस निकालने के लिए, एक से अधिक निकासी विधि का एक संयोजन के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, के रूप में एक डबल और चौगुनी निकासी को लागू करने से वी.एस. ईपीएस उपज की वृद्धि के साथ दिखाया गया है, एक ही निकासी के सभी संरचनात्मक ईपीएस निकालने के लिए नहीं होगा। शराब निकासी गर्मी और क्षारीय शर्तों के साथ लगातार मिश्रण के संयोजन एक कठोर ईपीएस निष्कर्षण विधि है। इस कारण से यह संभव है कि कुछ intracellular सामग्री ईपीएस के साथ एक साथ निकाला जाता है। सेल भौतिक और रासायनिक निष्कर्षण तकनीक (sonication 31,32, 31,32 NaOH, EDTA 11,32, सीईआर 32, M से गर्मी 32 और उच्च कतरनी दरों की वजह से किया जा सकता है19 ixing), बरामद ईपीएस में intracellular सामग्री की उपस्थिति अभी भी सत्यापित किया जाना चाहिए। बरामद ईपीएस में शामिल है कि क्या intracellular सामग्री विश्लेषण नहीं किया गया निकाले ईपीएस की आयनिक जेल के गठन की संपत्ति है, इस शोध का मुख्य लक्ष्य है। भविष्य के अनुसंधान निकाले ईपीएस में intracellular सामग्री की पहचान करने पर ध्यान दिया जाएगा।
AGS के हाइड्रोजेल मैट्रिक्स solubilizing संरचनात्मक ईपीएस निकालने के लिए महत्वपूर्ण है
ईपीएस रूपों AGS में एक घने और कॉम्पैक्ट हाइड्रोजेल मैट्रिक्स। हालांकि इस तरह के ईपीएस polysaccharides, प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, (phospho) लिपिड, humic पदार्थों और कुछ कहनेवाला पॉलिमर 7,5,8, के रूप में उन सभी को नहीं कार्बनिक अणुओं के विभिन्न वर्गों में शामिल एक जेल के रूप में। केवल वे ही लोग जेल के गठन पॉलिमर यहां ईपीएस में संरचनात्मक पॉलिमर के रूप में माना जाता है।
ईपीएस एक्सट्रेक्शन का उद्देश्य पहले ईपीएस solubilize के लिए और फिर solubilized ईपीएस में जमा है। अगर संरचनात्मक ईपीएस (यानी, टीवह एक हाइड्रोजेल गठन ईपीएस) निकासी का लक्ष्य है, AGS की जेल मैट्रिक्स पहले solubilized किया जाना है। केवल तरीकों कि जेल मैट्रिक्स solubilize सकते संरचनात्मक ईपीएस निकालने में सक्षम हैं। इस शोध में, कुछ अक्सर इस्तेमाल इस तरह के centrifugation 10 के रूप में ईपीएस निकासी तरीकों – 15, 10,14,15 sonication, EDTA 10 – 12,14,15, formaldehyde + NaOH 10 – 15 और formamide + NaOH 13 कुशलता संरचनात्मक को अलग नहीं कर सकता ईपीएस। यह सच है कि एरोबिक कणिकाओं की हाइड्रोजेल मैट्रिक्स इन तरीकों से solubilized नहीं किया गया था के कारण है। इस कारण से, धारा 4 में स्थिरता परीक्षण केवल EDTA, formamide + NaOH में वर्तमान परिस्थितियों और formaldehyde + NaOH के निष्कर्षण के साथ प्रदर्शन किया गया। ये तीन एक्सट्रेक्शन संरचनात्मक ईपीएस को अलग-थलग करने में सक्षम नहीं थे, लेकिन अब भी सबसे ज्यादा वी.एस. ईपीएस उपज इसके अलावा ना 2 3 सीओ निकासी प्राप्त की। स्थितियां ओच ना 2 3 सीओ निष्कर्षण इस निष्कर्षण विधि स्पष्ट रूप से AGS मैट्रिक्स solubilized के रूप में लागू नहीं किया गया। इसलिए स्थिरता परीक्षण के दौरान लागू की स्थिति प्रतिनिधि माना जाता था।
कटियन विनिमय राल (सीईआर), एक और अक्सर इस्तेमाल किया ईपीएस निष्कर्षण विधि, साथ निकासी, इस तुलना के लिए विचार नहीं किया गया सीईआर के साथ ईपीएस निकासी पर पिछले अध्ययनों यहां इस्तेमाल किया रासायनिक एक्सट्रेक्शन से बेहतर परिणाम उपज नहीं था के रूप में।
AGS में ईपीएस जेल के गठन
जेल के गठन ईपीएस AGS के हाइड्रोजेल मैट्रिक्स में संरचनात्मक ईपीएस के रूप में माना जाता है। यह ओर इशारा करते हुए इस तरह के आयनिक जैल, तापमान प्रेरित जैल और पीएच प्रेरित जैल के रूप में हाइड्रोजेल के विभिन्न प्रकार देखते हैं कि लायक है। इस अध्ययन से केवल ईपीएस कि आयनिक जैल फार्म पर केंद्रित है। संरचनात्मक जेल निकाली गई सामग्री के बड़े अंश के बारे में, इस प्रमुख संरचनात्मक ईपीएस होने की संभावना है। वहाँ निश्चित रूप से संभावनाएं हैं कि ईपीएस के अन्य प्रकारउस रूप हाइड्रोजेल के विभिन्न प्रकार (जैसे, पीएच प्रेरित जेल 28) एरोबिक कणिकाओं के समान या अन्य प्रकार में मौजूद हैं। फिर भी, कोई फर्क नहीं पड़ता हाइड्रोजेल किस तरह का लक्ष्य रखा गया है, solubilizing ईपीएस जेल मैट्रिक्स जेल के गठन ईपीएस निकालने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है।
वर्तमान में, छोटे से अनुसंधान बारीक कीचड़ की संरचनात्मक ईपीएस पर किया गया है। शराब निष्कर्षण इस प्रोटोकॉल में वर्णित AGS से जेल के गठन ईपीएस निकालने में सक्षम है और संरचनात्मक ईपीएस को चिह्नित करने के लिए भविष्य के अध्ययनों में इस्तेमाल किया जाएगा। और अधिक शोध AGS, संरचनात्मक ईपीएस और गैर संरचनात्मक ईपीएस पर किया जाना बेहतर प्रक्रिया और दानेदार और ईपीएस के समारोह को समझने की जरूरत है। यही कारण है कि सूक्ष्मजीवों ईपीएस की इतनी बड़ी राशि है, ईपीएस की सटीक रचना है और कैसे ईपीएस की संरचना पर्यावरण परिवर्तन के आधार पर संशोधित किया गया है क्या उपज: विशेष रूप से निम्नलिखित तीन अंक की जांच की जानी चाहिए। का पता लगाने और इसमें शामिल सभी यौगिकों और उनके interacti का विश्लेषणons biofilms और कैसे उन्हें अपने लाभ के लिए उपयोग करने के लिए समझने में मदद मिलेगी।
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was financially supported by the SIAM Gravitation Grant 024.002.002, the Netherlands Organization for Scientific Research and by the Dutch Technology Foundation (STW – Simon Stevin Meester 2013). The authors want to thank Mario Pronk for providing the granular sludge samples.
Materials
| 250 ml baffled flask | Kimble | 25630-250 | |
| 1000 ml glass beaker | VWR | 213-1128 | |
| RCT basic, magnetic stirrer with thermometer | IKA | 3810000 | |
| sodium carbonate decahydrate | Merck KGaA | 1063911000 | |
| 50 ml centrifugation tubes | greiner bio-one | 227261 | |
| Multifuge 1 S-R, centrifuge | Heraeus/Thermo Scientific | – | |
| hydrochloric acid, 37 % | Sigma-Aldrich | 30721-1L-GL-D | |
| 250 ml glass beaker | VWR | 213-1124 | |
| calcium chloride dihydrate | Merck KGaA | 1023821000 | |
| 1 ml Pasteur Pipette | Copan | 201C |
Referências
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