Extraction des substances Structural extracellulaires polymériques de Aerobic Granular Sludge

Summary

Le protocole fournit une méthodologie pour solubiliser aérobie granulaire boues afin d'en extraire les polymères extracellulaires alginate-like (ALE).

Abstract

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na₂CO₃) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca²⁺). From the six extraction methods used, only the Na₂CO₃ extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca²⁺. The Ca²⁺-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.

Introduction

Au cours des dernières années , la boue granulaire (AGS) processus aérobie est devenu un procédé de traitement biologique des eaux usées populaire, appliquée avec succès à plusieurs à grande échelle des usines de traitement des eaux usées ^1. Contrairement au procédé classique de boues activées, dans le processus les AGS les microorganismes forment des granules au lieu de flocs ^2. Ces granules ont une meilleure décantation, sont capables de résister à des taux plus élevés de charge organique, et ont une plus grande tolérance à la toxicité de flocs de boues activées ^3.

Contrairement à biofilms, AGS est formé spontanément sans intervention d'un matériau de support ^4. AGS, comme dans les films biologiques, les micro – organismes produisent une quantité importante de substances polymères extracellulaires fortement hydratés (EPS) ⁵ pour former une matrice d'hydrogel dans laquelle elles sont auto-immobilisé ^{4 – 6.} EPS sont un mélange complexe comprenant des polysaccharides, des protéines, des acides nucléiques (phospho) des lipides, des substances humiques et certains polymères intercellulaires ^5,7,8. Ces substances polymères interagissent les uns avec les autres par des forces électrostatiques, des liaisons hydrogène, forces ioniques attractifs et / ou des réactions biochimiques, etc. ^5, formant une structure de réseau tertiaire dense et compact. Les polymères EPS qui sont capables de former des hydrogels ^4,9 et contribuer à la formation de la structure du réseau tertiaire sont à cet égard considéré comme BPA structurel, un sous – ensemble du nombre total de BPA.

EPS sont responsables de la structure chimique et les propriétés physiques des granulés ^5. Il est donc crucial de comprendre la fonction de chaque composé EPS. Diverses approches sont appliquées pour extraire EPS ^10-15. Cependant, en raison de leur extrême complexité, il est presque impossible d'extraire tous les composants EPS par une seule méthode. À ce jour, il n'y a pas de «one size fits all" méthode pour l'extraction EPS. Le choix de la méthode d'extraction , non seulement influe sur le prix total, mais aussi la composition des polymères récupérés ^{13,16 – 20.} Selon le type de boue et les EPS d'intérêts différentes méthodes sont nécessaires.

Extraction des polymères gélifiants, caractériser leurs propriétés et étudier leurs interactions les uns avec les autres et avec EPS non gélifiants aidera à révéler le rôle des EPS en aérobie formation granulaire des boues. En outre, les polymères formant des gels biopolymères sont aussi utiles dans des applications industrielles. Une application possible a déjà été démontré en utilisant des polymères formant un gel à partir d' AGS en tant que matériau de revêtement pour augmenter la résistance à l'eau du papier ^21.

Par conséquent, des procédés d'extraction, spécifiques pour les BPA de formation de gel sont nécessaires. Le but de cette étude est de développer une méthodologie pour extraire EPS de formation de gel d'AGS. Six méthodes d'extraction ^{10 – 1}5,22, qui sont fréquemment utilisés dans la littérature, ont été sélectionnés pour extraire EPS de AGS. Le montant total et la propriété de formation de gel des EPS extraits ont été comparés pour chaque méthode.

Protocol

NOTE: Les AGS ont été recueillies dans le réacteur pilote Nereda à l'usine de traitement des eaux usées Utrecht, aux Pays-Bas. Le réacteur a été alimenté par les eaux usées municipales. La boue granulaire avait un indice de volume des boues (SVI 5min) de 59,5 ml / g de VSS. La boue a été échantillonnée en Avril à la fin d'un cycle aérobie. Après le prélèvement, la boue a été immédiatement transporté au laboratoire, tamisé et conservé à -20 ° C jusqu'à utilisation. 1. EPS Extraction NOTA: Centrifugeuse de boue granulaire à 4000 x g et 4 ° C pendant 20 mn, puis décanter le surnageant. Collecter des granulés dans le culot pour les extractions. Les solides totaux (TS) et les matières volatiles (VS) des granules ont été déterminées par les méthodes classiques 23. Le facteur de conversion entre le poids humide de granule – le poids des granulés prises directement à partir de la pastille – et le TS a été déterminée avant l'extraction. Toutes les extractions ont été réalisées en triple exemplaire. NOTE: 3 g g humideranules ont été utilisés pour chaque méthode d'extraction. Leurs TS et les valeurs VS (0,39 g de TS et 0,34 g VS), mesurée en triple, ont été utilisés pour calculer le rendement d'extraction. Extraction de centrifugation 11 Transfert 3 g (poids humide) de granulés dans un tube de centrifugation et remplir le tube de centrifugation à 50 ml avec de l'eau déminéralisée. Secouer légèrement le tube de centrifugation à la main. Centrifuger le tube de centrifugation contenant le mélange à 4000 x g et 4 ° C pendant 20 min. Recueillir le surnageant dans un récipient en verre, jeter le culot et continuer avec le surnageant comme décrit dans la section 1.7. Extraction de sonication 10 Transfert 3 g (poids humide) de granulés dans un tube de centrifugation et remplir le tube de centrifugation à 50 ml avec de l'eau déminéralisée. Appliquer sonication pulsée sur la glace pendant 2,5 min à 40 W au mélange. Centrifuger la centrifugationle tube contenant le mélange à 4000 x g et 4 ° C pendant 20 min. Recueillir le surnageant dans un récipient en verre, jeter le culot et continuer avec le surnageant comme décrit dans la section 1.7. L' acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) extraction 11 Transfert 3 g (poids humide) de granulés dans une bouteille en verre de 100 ml et remplir la bouteille de 50 ml avec 2% (p / v) solution d'EDTA. Légèrement secouer la bouteille à la main et de le stocker dans le réfrigérateur à 4 ° C pendant 3 heures. Transférer le mélange dans un tube de centrifugation de 50 ml. Centrifuger le tube de centrifugation contenant le mélange à 4000 x g et 4 ° C pendant 20 min. Recueillir le surnageant dans un récipient en verre, jeter le culot et continuer avec le surnageant comme décrit dans la section 1.7. Formamide – extraction de l' hydroxyde de sodium (NaOH) 13 Transfert 3 g (poids humide) de granulés dans un 100ml bouteille en verre et remplir la bouteille de 50 ml avec de l'eau déminéralisée. Ajouter 0,3 ml de 99% de formamide. Légèrement secouer la bouteille à la main et de le stocker dans le réfrigérateur à 4 ° C pendant 1 heure. Ajouter 20 ml de NaOH 1 M à la suspension de granulés. Légèrement secouer la bouteille à la main et de le stocker dans le réfrigérateur à 4 ° C pendant 3 heures. Transférer le mélange uniformément en deux 50 ml tube de centrifugation. Centrifuger les Tubes de centrifugation contenant le mélange à 4000 x g et 4 ° C pendant 20 min. Recueillir le surnageant dans un récipient en verre, jeter le culot et continuer avec le surnageant comme décrit dans la section 1.7. Extraction de NaOH 11 – Formaldéhyde Transfert 3 g (poids humide) de granulés dans une bouteille en verre de 100 ml et remplir la bouteille de 50 ml avec de l'eau déminéralisée. Ajouter 0,3 ml 37% de formaldéhyde. Légèrement secouer la bouteille à la main et le magasinau réfrigérateur à 4 ° C pendant 1 heure. Ajouter 20 ml de NaOH 1 M à la suspension de granulés. Légèrement secouer la bouteille à la main et de le stocker dans le réfrigérateur à 4 ° C pendant 3 heures. Transférer le mélange uniformément en deux 50 ml tube de centrifugation. Centrifuger les Tubes de centrifugation contenant le mélange à 4000 x g et 4 ° C pendant 20 min. Recueillir le surnageant dans un récipient en verre, jeter le culot et continuer avec le surnageant comme décrit dans la section 1.7. Haute température – extraction de carbonate de sodium (Na 2 3 CO) 9,22,24 Préchauffer 150 ml d'eau du robinet dans un bécher de 1000 ml, en verre sur un agitateur magnétique à 80 ° C. Transfert 3 g (poids humide) de granulés dans 250 ml à chicanes flacon et remplir le flacon de 50 ml avec de l'eau déminéralisée. Ajouter 0,25 g de Na 2 CO 3 anhydre ou 0,67 g de Na 2 CO 3 • 10H _{2 O dans le flacon pour obtenir une solution à 0,5% (p / v) de Na 2 CO 3 de concentration. Placer le récipient contenant le mélange dans le bain d'eau. Couvrir le flacon et le verre de bêcher séparément avec du papier d'aluminium pour éviter l'évaporation. Agiter le mélange pendant 35 min à 400 rpm et 80 ° C. Transférer le mélange dans un tube de centrifugation de 50 ml. Centrifuger le tube de centrifugation contenant le mélange à 4000 x g et 4 ° C pendant 20 min. Recueillir le surnageant et jeter le culot. TS VS et mesure de tous les extraits selon des procédés standard 23. Prenez le surnageant et dialyser pendant 24 heures contre 1000 ml d'eau ultrapure (sac de dialyse avec 3.500 Da poids moléculaire coupé (MWCO)) 11,12. Changer l'eau de dialyse après 12 heures afin d'améliorer l'effet de la dialyse. Transférer une fraction raisonnable (environ un tiers) du surnageant dialysé àun plat en aluminium pour TS et VS mesure 23. NOTE: Sécher l'échantillon pendant une nuit à 105 ° C. La différence de poids du plat d'aluminium vide et le plat d'aluminium contenant l'échantillon séché est le contenu de TS. Gravez ensuite le même plat d'aluminium contenant l'échantillon à 550 ° C pendant 2 heures. La différence de poids entre le plat d'aluminium vide et le plat d'aluminium contenant l'échantillon brûlé est la teneur en cendres. La différence entre le contenu TS et de cendres est le contenu VS. Pour chaque extrait, transférer la fraction résiduelle du surnageant dialysé à 10 béchers ml en verre. Épaissir le surnageant pendant 2 jours à 60 ° C jusqu'à un volume final de 1-2 ml pour augmenter la concentration en polymère dans le surnageant. 2. extracellulaires Polymer (ALE) Extraction Alginate-like Dialyser l'extrait obtenu à l'étape 1.6.8 selon l'étape 1.7.1. Transférer l'extrait dialysé dans un bécher de 250 ml en verre. Lently remuer l'extraction à 100 rpm et la température ambiante. surveiller en permanence des changements de pH avec une électrode de pH, tout en ajoutant de l'acide chlorhydrique 1 M (HCl) à un pH final de 2,2 ± 0,05 pour obtenir ALE sous la forme acide. Après ajustement du pH à 2,2, de transférer l'extrait dans un tube de centrifugation et centrifuger de 50 ml à 4000 x g et 4 ° C pendant 20 min. Jeter le surnageant et recueillir le culot de type gel. Le culot de type gel est ALE sous la forme acide. Pour obtenir le sodium (ou de potassium), sous forme d'ALE, ajouter lentement du NaOH 0,5 M (ou 0,5 M d'hydroxyde de potassium) dans le gel obtenu à l'étape 2.4, en mélangeant le gel lentement avec une baguette de verre à la main jusqu'à ce qu'un pH de 8,5 soit atteint. 3. Ionic Hydrogel Formation test NOTE: Afin de vérifier si les EPS extraits avaient ioniques propriétés de formation d'hydrogel, un test de formation de perle avec des ions Ca 2+ a été utilisé 25. Après épaississement de l'extrait à l'étape 1.7.3 pourun volume de 1-2 ml, mélanger lentement le mélange avec un bâton de verre et d'ajuster son pH à 8,5 avec NaOH 0,5 M. Prendre l'extrait de l' étape 3.1 ou ALE de sodium de l' étape 2.5 et lentement goutte à goutte l'extrait avec une pipette Pasteur en 2,5% (p / v) de chlorure de calcium (CaCl 2) solution. NOTE: Si l'EPS extrait a gel d'hydrogel ionique propriétés de formation, en forme de goutte (sphériques) perles seront formées. Si l'EPS extrait a pas de gel hydrogel ionique propriétés de formation, l'extrait se disperse dans la solution de CaCl 2. 4. Test de stabilité de l'Ionic Hydrogel NOTE: Pour mieux comprendre le rôle de l'hydrogel EPS ioniques AGS formation de structure, des essais de stabilité ont été effectuées sur les billes d'hydrogel ionique de Na 2 CO 3, extrait collectés à l' étape 3.2. Maintenir les billes d'hydrogel pendant 30 minutes dans la solution de CaCl 2. Utilisez une cuillère pour enlever les billes d'hydrogel du CaCl 2} solution et de diviser les perles en quatre fractions égales. fraction de magasin 1 dans 10 ml d'eau déminéralisée pendant 4 heures à 4 ° C. Les tests de stabilité suivants ont été effectués de la même manière que celle décrite dans les méthodes d'extraction de 1,3 – 1,5. la fraction de magasin 2 dans 10 ml de 2% (p / v) d'une solution d'EDTA pendant 3 heures à 4 ° C. fraction de magasin 3 dans 7,15 ml de l'eau déminéralisée avec 60 ul 99% de formamide pendant 1 h à 4 ° C. Puis ajouter M NaOH 2,85 ml 1 et fraction de magasin 3 pendant 3 heures à 4 ° C. fraction de magasin 4 dans 7,15 ml de l'eau déminéralisée avec 60 ul 37% de formaldéhyde pendant 1 heure à 4 ° C. Puis ajouter M NaOH 2,85 ml 1 et fraction de magasin 4 pendant 3 heures à 4 ° C. Surveiller s'il y a désintégration visible des perles pendant le stockage dans les conditions décrites dans 04.03 à 04.06 pour évaluer si les perles résistent aux conditions d'extraction.

Representative Results

extraction EPS L'apparition de granules , après l' application de différentes procédures d'extraction EPS est représenté sur la figure 1. La structure de la forme et du gel de granules étaient intacts après centrifugation (figure 1a) et l' extraction de l' EDTA (figure 1c). Les granules ont été brisées en fragments de dimensions différentes par sonication. La turbidité de la phase liquide pourrait être due à une suspension de petits fragments (figure 1b) comme la turbidité a diminué fortement après centrifugation. Formamide et le formaldéhyde seul n'a pas eu d'incidence sur la modification de la forme des granulés et de sa structure de gel (données non présentées). Après l'addition de NaOH, la phase liquide tourné jaunâtre. Certains matériaux floconneux a été détachée de la surface des granulés et a formé une couche sur le dessus des granulés installés (figure 1d et 1e). Cependant, la forme de lagranulés n'a pas été modifié. L'addition de NaOH apparemment améliorée solubilisation du BPA, mais pourrait ne pas endommager la structure de la matrice de gel. En comparaison, les granules ont complètement disparu après Na 2 CO 3 extraction (Figure 1f). Au lieu d'un mélange de particules comme de la gelée liquide et minuscules sol-like ont été formés, montrant la matrice de gel de granulés a en effet été solubilisé. Figure 1. aérobie boue granulaire EPS extractions. Pour une meilleure visualisation de l'impact de chaque méthode d'extraction sur les granulés, des expériences ont été menées dans 25 ml bouteilles en verre. Une fois la procédure d'extraction, les extraits ont été conservés pendant 1 heure à la température ambiante pour permettre à la matière en suspension se déposer. (A) l' extraction de centrifugation, (b) l' extraction de la sonication, (c) l' extraction de l' EDTA, (d) de formamide – NaOH supplémentairection, (e) Formaldéhyde – extraction NaOH, (f) à haute température -. Na 2 CO 3 extraction S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Rendement EPS par rapport à la fraction SV pour chaque méthode est illustrée sur la figure 2. Le rendement est présenté en mg par g EPS VS VS initial granulé. La quantité d'EPS obtenu par le formaldéhyde + NaOH, le formamide + NaOH et Na 2 CO 3 + + chaleur de mélange est supérieure à celle de la centrifugation, sonication et l' extraction de l' EDTA. Des résultats similaires pour ces techniques d'extraction ont également été présentés par des études antérieures 11 – 13,15 indiquant que des conditions alcalines améliorent la solubilité des EPS 26,27. La quantité de BPA récupéré par Na 2 CO 3 était le plus élevé, plus de 20 fois supérieure à celle obtenue uniquement par centrifugation. En outre, le rendement total EPS du Na 2 CO 3 , l' extraction peut être améliorée par des extractions multiples. Une deuxième extraction en utilisant le culot jeté à l'étape 1.6.8 (section de protocole) de la première extraction a augmenté le rendement total de 28%, une extraction quadruple a même augmenté le rendement total de 46%. Figure 2. Les résultats de toutes les méthodes d'extraction par rapport au rendement VS et la teneur en cendres. Pour chaque extraction , la première barre représente le rendement VS en mg VS EPS par g initial VS granule. La deuxième barre représente le pourcentage en poids de cendres dans les TS extraites. Les barres d'erreur représentent l'écart-type des trois extractions effectuées pour chacune des techniques d'extraction."_blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Polymère extracellulaire (ALE) extraction Alginate-like Après que le pH de l'EPS extraites par le Na 2 CO 3 , l' extraction a été ajusté à 2,2, 63% du total VS a été précipité. Le précipité est 25 ALE acide. La fraction résiduelle était probablement EPS qui peuvent être solubilisés dans les conditions d'extraction, mais ne peut former un précipité à un pH de 2,2. Test de formation d'hydrogel ionique granulés aérobie ont été décrits comme étant semblable à un hydrogel. Le procédé de granulation a été considéré comme un phénomène de formation de gel avec glucosides comme agent gélifiant 4,9,25,28. Normalement, le Ca 2+ est l' un des cations les plus courants dans les eaux usées. En outre, il se lie facilement avec des polysaccharides acides (par exemple,les alginates et l' acide poly-galacturonique), probablement en tant que contre-ion pour la médiation de 29 gélification. Ainsi, résultant en un hydrogel ioniquement réticulé. Il a été observé que l'addition des ions de Ca peut accélérer la boue aérobie granulation 30. Par conséquent, Ca 2+ -EPS (liste hydrogel ionique) pourrait jouer un rôle important dans la construction de la structure de la matrice de gel en aérobie granulaire boues. À cet égard, si les EPS extraites forme un hydrogel ionique avec des ions Ca 2+ pourrait être utilisé comme un test pour vérifier si le EPS extrait est un polymère de structure contribuant à la formation de la matrice de gel granulaire aérobie boue 9. Dans cette recherche, pour l'EPS extraites de l' AGS (figure 3a) par diverses méthodes, seules les EPS extraites par Na 2 CO 3 eu lieu la forme d'une goutte dans 2,5% (p / v) de solution de CaCl 2 et forment des billes d'hydrogel ioniques stables .En outre, l'ALE de sodium obtenu à partir de cette EPS par étapes supplémentaires (extraction de polymère ALE, Figure 3b) affiche la même propriété ainsi. La couleur et la morphologie des Ca2 + billes de gel -ALE (Figure 3c) sont similaires à la boue granulaire aérobie (Figure 3a). Apparemment, l'EPS extraits par le procédé de Na 2 CO 3 , contribue à la formation de la matrice de gel granulaire aérobie de boues. ALE, qui est un composant principal de cet EPS sont des polymères de structure, capables de former un hydrogel ionique. Essai de stabilité de l'hydrogel ionique Il a été observé que lors de l' extraction des EPS, des granules aérobies ont conservé leur forme sphérique dans de l' EDTA, du formaldéhyde + NaOH et formamide + NaOH (Figure 1). Afin de comprendre si les polymères structuraux extraites jouent un rôle dans la stabilité des granules, des billes de Ca2 + ont été -ALEtraitée exactement de la même manière que les granulés d'aérobie au cours de l'extraction. Il est intéressant de Ca 2+ perles -ALE affichent les stabilités similaires à celui de l' AGS (figure 3D – 3F), à savoir Ca2 + -ALE billes sont extrêmement stables dans l' EDTA. Il y avait peu de quantité de ALE détachée de la surface de Ca 2+ perles -ALE (minuscules floc brunâtre Figure 3e et 3f), lorsque les Ca2 -ALE perles avaient été trempés dans du formol + NaOH et formamide + NaOH pendant trois heures , respectivement. Cette similitude en termes de stabilité entre Ca 2+ Les perles -ALE et granules aérobies indique que ALE sont une partie des importants polymères structuraux formant la matrice de gel AGS. Figure 3. granules aérobies et ALE extrait. (A) Granules en pr eau déminéraliséeextraction IOR. (B) ALE acide (extrait selon les paragraphes 1.6 et 2) après centrifugation à 4000 x g et 4 ° C pendant 20 min. Les résultats de l'essai de stabilité de l'hydrogel ionique. (C) Ca 2+ -ALE-perles stockées dans de l' eau déminéralisée pendant 4 heures à 4 ° C. (D) Ca 2+ -ALE-perles stockées dans 2% d' EDTA, pendant 3 heures à 4 ° C. (E) Ca 2+ -ALE-perles stockées dans formamide + NaOH pendant 4 heures à 4 ° C. (F) Ca 2+ -ALE-perles stockées dans le formol + NaOH pendant 4 heures à 4 ° C. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Remarques pour la section de protocole
L'extraction de l'EPS / ALE est décrit pour un volume de 50 ml et 3 g de granulés. Ces valeurs sont des directives. Extractions avec des concentrations plus élevées de granules peuvent diminuer le rendement des EPS extraits. Lors de l'extraction d'ale la température doit être maintenue constante à 80 ° C pendant 30 min. Le temps nécessaire pour que le mélange se réchauffer (environ 5 min) est inclus dans le protocole. En outre, l'efficacité d'extraction est améliorée en utilisant une barre d'agitation magnétique de la même taille que le diamètre du fond du flacon. Cela se traduira par de bonnes propriétés de mélange et d'effets de fraisage, favorisant l'extraction de l'EPS.

Plus tard dans la section de protocole, et TS VS rendements de toutes les extractions (surnageant recueilli dans les étapes 1.1-1.6) sont déterminées. La dialyse doit être effectuée avant la TS et VS mesure de diminuer les éventuelles erreurs dues à la présence de produits chimiques utilisés pour les extractions. UNEMWCO de 3500 Da est recommandé de retirer ces produits chimiques, tout en conservant les macromolécules EPS dans le sac de dialyse. Le sac de dialyse doit avoir un volume plus grand que le volume de l'extrait. Cela est nécessaire, car le volume de l'extrait va augmenter au cours de la dialyse (par exemple, pour l' extraction de l' EDTA jusqu'à l' augmentation du volume de 40%). L'étendue de l'élimination chimique par dialyse peut être déterminée en mesurant le pH de l'échantillon avant et après la dialyse. En variante, des mesures de conductivité de l'eau de dialyse montrent l'étendue de l'élimination d'ions.

Pour obtenir ALE du total extrait EPS (étapes 1,6 et 2) l'étape de dialyse est facultative. Néanmoins, la dialyse a trois avantages: elle réduit la quantité d'acide chlorhydrique nécessaire à la précipitation, il améliore le transfert de masse de l'acide dans l'extrait et diminue la teneur en cendres de l'ALE obtenu. Pour la précipitation d'ALE, il est recommandé d'utiliser un récipient en verre d'un volume beaucoup plus grand que le extract. Na ₂ CO ₃ est normalement dans l'extraction surdosé. HCl ajoutée va d' abord réagir avec le Na ₂ CO ₃ , à gauche dans l'extrait, ce qui entraîne la formation de dioxyde de carbone et, si l'échantillon n'a pas été dialysée avant, dans la formation de mousse. Au cours de l'addition de HCl, l'extrait doit être agité lentement avec une barre d'agitation magnétique de la même taille que le fond du récipient. Une barre d'agitation de cette taille et une agitation lente se traduira par un mélange homogène sans casser la structure du précipité. Si des touffes de gel acides sont formés dans l'extrait, le récipient doit être tourbillonné légèrement à la main. La précipitation est réalisée avec une concentration d'acide de 1 M pour éviter une augmentation importante du volume de l'extrait tout en obtenant une répartition homogène de l'acide dans l'échantillon. Les concentrations d'acide plus élevées peuvent entraîner une diminution de la formation de la région de pH et des touffes de gel acide. Un pH inférieur à 2,0 diminue la quantité d'ALE qui peut être récupéré, sans doute en raison de changements structurelsdes polymères à un pH inférieur. Il est donc important de maintenir le pH final à 2,20 ± 0,05.

Limites
La méthode d'extraction ALE vise à extraire les polymères extracellulaires structurelles des EPS de AGS ou biofilms en général et ne vise pas à extraire tous les EPS présents. Pour extraire tous les EPS, une combinaison de plus d'un procédé d'extraction est nécessaire. En outre, comme le montre l'augmentation du rendement VS _EPS en appliquant une extraction double et quadruple, une seule extraction ne sera pas extraire tous les EPS structurels. l'extraction d'ALE est un procédé d'extraction EPS dure, en combinant un mélange constant avec des conditions de chaleur et alcalino-terreux. Pour cette raison, il est possible que certains matériel intracellulaire est extrait conjointement avec l'EPS. Bien que la lyse cellulaire peut être causée par des techniques d'extraction physique et chimique (sonication ^{31,32, 31,32} NaOH, EDTA ^11,32, CER ^{32, 32} et chaleur à cisaillement élevé des taux par mIXING ^19), la présence de matière intracellulaire en EPS récupérées doit encore être vérifiée. La propriété ionique de formation de gel des EPS extraites est l'objectif principal de cette recherche, si l'EPS récupéré contient du matériel intracellulaire n'a pas été analysé. La recherche future se concentrera sur l'identification matériel intracellulaire dans les EPS extraits.

Solubiliser la matrice d'hydrogel de l' AGS est cruciale pour extraire EPS structurelles
formes EPS une matrice d'hydrogel dense et compact dans AGS. Bien que EPS contient différentes classes de macromolécules organiques tels que des polysaccharides, des protéines, des acides nucléiques (phospho) lipides, des substances humiques et des polymères intercellulaires ^7,5,8, pas tous former un gel. Seuls les polymères gélifiants sont ici considérés comme des polymères de structure en EPS.

Le but de l'extraction EPS est d'abord solubiliser EPS, puis de recueillir les EPS solubilisées. Si les EPS structurelles (c. -à- til EPS formant un hydrogel) est la cible de l'extraction, la matrice de gel d'AGS doit être solubilisé en premier. Seules les méthodes qui peuvent solubiliser la matrice de gel sont capables d'extraire EPS structurelles. Dans cette recherche, certains utilisés fréquemment EPS procédés d'extraction tels que la centrifugation ^{10 – 15, 10,14,15} sonification, de l' EDTA ^{10 – 12,14,15,} du formaldéhyde + NaOH ^{10 – 15} et + NaOH ¹³ formamide n'a pas pu isoler efficacement la structure EPS. Ceci est dû au fait que la matrice d'hydrogel des granulés aérobie n'a pas été solubilisée par ces méthodes. Pour cette raison, les tests de stabilité à l'article 4 ont été effectuées uniquement avec des conditions présentes dans l'EDTA, NaOH formamide + et le formaldéhyde + extraction NaOH. Ces trois extractions ne sont pas capables d'isoler EPS structurels, mais encore obtenu le rendement le plus élevé VS _EPS outre le ₂ CO ₃ extraction Na. Conditions of le Na ₂ CO ₃ extraction n'a pas été appliquée car cette méthode d'extraction clairement solubiliser la matrice AGS. Par conséquent, les conditions appliquées au cours de l'essai de stabilité ont été considérés comme représentatifs.

Extraction avec de la résine d'échange de cations (CER), une autre méthode d'extraction EPS fréquemment utilisé, n'a pas été considéré pour cette comparaison, car les études antérieures sur l'extraction des EPS avec CER n'a donné de meilleurs résultats que les extractions chimiques utilisées ici.

EPS Gel filmogène dans AGS
EPS gélifiantes sont considérés comme l'EPS structurels dans la matrice d'hydrogel d'AGS. Il convient de souligner qu'il existe différents types d'hydrogels tels que des gels ioniques, gels induites par la température et les gels pH induits. Cette étude porte uniquement sur les EPS qui forment des gels ioniques. En ce qui concerne la grande fraction de matériau de gel de structure extraite, cela est susceptible d'être l'EPS structurelles dominantes. Il y a certainement des possibilités que d'autres types d'EPScette forme de différents types d'hydrogels (par exemple, pH gel induite ²⁸⁾ existe dans le même ou un autre type de granules aérobies. Néanmoins, peu importe quel type d'hydrogel est ciblé, solubilisation de la matrice de gel EPS est l'étape la plus importante pour extraire EPS de formation de gel.

Actuellement, peu de recherches ont été effectuées sur EPS structurelles de boue granulaire. L'extraction ALE décrit dans ce protocole est capable d'extraire l'EPS gélifiantes de l'AGS et seront utilisées dans des études ultérieures pour caractériser EPS structurelles. Plus de recherche doit être fait sur AGS, EPS structurelles et non structurelles EPS afin de mieux comprendre le processus et la fonction de la granulation et EPS. Surtout les trois points suivants doivent être étudiés: pourquoi les micro-organismes produisent une telle quantité d'EPS, quelle est la composition exacte des EPS et comment est la composition des EPS modifiée en fonction des changements environnementaux. La détection et l'analyse de tous les composés impliqués et leur interactions vous aidera à comprendre les biofilms et la façon de les utiliser à notre avantage.

Materials

250 ml baffled flask	Kimble	25630-250
1000 ml glass beaker	VWR	213-1128
RCT basic, magnetic stirrer with thermometer	IKA	3810000
sodium carbonate decahydrate	Merck KGaA	1063911000
50 ml centrifugation tubes	greiner bio-one	227261
Multifuge 1 S-R, centrifuge	Heraeus/Thermo Scientific	–
hydrochloric acid, 37 %	Sigma-Aldrich	30721-1L-GL-D
250 ml glass beaker	VWR	213-1124
calcium chloride dihydrate	Merck KGaA	1023821000
1 ml Pasteur Pipette	Copan	201C