Avtalen gir en metode for å oppløse aerobic granulert slam for å trekke alginat-lignende ekstracellulære polymerer (ale).
To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na2CO3) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca2+). From the six extraction methods used, only the Na2CO3 extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca2+. The Ca2+-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.
De siste årene har aerobic granulære slam (AGS) prosessen har blitt en populær biologisk rensing av avløpsvann prosess, med hell brukes på flere fullskala renseanlegg 1. I motsetning til den konvensjonelle aktiverte slamprosess, i AGS behandle de mikroorganismer som danner granuler i stedet for fnokker 2. Disse granulater har bedre settleability, er i stand til å tåle høyere organiske lasting priser, og har høyere toleranse for toksisitet enn aktivslam flocs 3.
I motsetning til biofilm, er AGS dannes spontant uten involvering av alle bærematerialet fire. I AGS, som i biofilmer, mikroorganismer produserer en betydelig mengde av sterkt hydratiserte ekstracellulære polymere stoffer (EPS) 5 for å danne en hydrogel matriks i hvilken de er selv immobilisert 4. – 6.. EPS er en kompleks blanding, som består av polysakkarider, proteiner, nukleinsyrer, (phospho) lipider, humus og noen inter polymerer 5,7,8. Disse polymere bestanddeler vekselvirker med hverandre gjennom elektrostatiske krefter, hydrogenbindinger, attraktive ioniske krefter og / eller biokjemiske reaksjoner, etc. 5, som danner en tett og kompakt tertiær nettstruktur. Polymerene i EPS som er i stand til å danne hydrogeler 4,9 og bidrar til dannelse av den tertiære nettstruktur er i denne henseende betraktes som strukturelle EPS, en delmengde av de totale EPS.
EPS er ansvarlig for den kjemiske struktur og fysikalske egenskaper av granuler 5. Det er derfor avgjørende å forstå funksjonen til hver EPS sammensatte. Ulike tilnærminger brukes til å trekke ut EPS 10-15. Men på grunn av sin ekstreme kompleksitet, er det nesten umulig å trekke ut alle EPS-komponentene ved en enkelt metode. Til dags dato er det ingen "one size fits all" metode for EPS utvinning. Valget av ekstraksjonsmetoden påvirker ikke bare den totale mengden, men også sammensetningen av den gjenopprettede polymerene 13,16 – 20. Avhengig av typen av slam og EPS av interesse forskjellige fremgangsmåter er påkrevd.
Ekstrahering av gel-dannende polymerer, som karakteriserer deres egenskaper og å undersøke deres interaksjon med hverandre og med ikke-geldannende EPS vil bidra til å avsløre rolle EPS i aerob granulert slamdannelse. Videre er de gel-dannende polymerer er også nyttige biopolymerer i industrielle anvendelser. En mulig anvendelse er allerede vist ved hjelp av gel-dannende polymerer fra AGS som et beleggmateriale for å øke motstandsdyktigheten overfor vann av papir 21.
Derfor blir ekstraksjonsmetoder, spesifikke for geldannende EPS nødvendig. Målet med denne studien er å utvikle en metode for å trekke gel-forming EPS fra AGS. Seks ekstraksjonsmetoder 10-15,22, som er ofte brukt i litteraturen, ble valgt for å ekstrahere EPS fra AGS. Den totale mengde og den geldannende egenskap av de ekstraherte EPS ble sammenlignet for hver metode.
Merknader til protokollen seksjon
Utvinningen av EPS / ALE er beskrevet for et volum på 50 ml og 3 g granuler. Disse verdiene er veiledende. Ekstraksjoner med høyere granule konsentrasjoner kan redusere utbyttet av de ekstraherte EPS. Ved utvinning av ALE temperaturen bør holdes konstant ved 80 ° C i 30 minutter. Den tid som kreves for blandingen til å varme opp (ca. 5 min) er inkludert i protokollen. Dessuten er ekstraksjon effekten forsterkes ved hjelp av en magnetisk rørestav av samme størrelse som diameteren av kolben bunnen. Dette vil resultere i gode blandeegenskaper og frese effekter, fremme utvinning av EPS.
Senere i protokollen delen, er TS og VS avkastning av alle utdrag (supernatant samlet i trinn 1,1-1,6) bestemt. Dialyse må utføres før TS og VS måling for å redusere mulige feil på grunn av tilstedeværelsen av kjemikalier som benyttes for ekstraksjon. ENMWCO av 3500 Da er anbefalt å fjerne disse kjemikaliene og samtidig beholde de EPS makromolekyler innenfor dialyse bag. Dialyseposen skal ha et større volum enn volumet av ekstraktet. Dette er nødvendig, fordi volumet av ekstraktet vil øke under dialyse (for eksempel for utvinning EDTA inntil 40% økning av volum). Graden av kjemisk fjerning ved dialyse kan bestemmes ved å måle pH-verdien i prøven før og etter dialyse. Alternativt kan konduktivitetsmålinger av dialyse vann vise omfanget av ione-fjerning.
For å få ALE fra den totale hentet EPS (trinn 1,6 og 2) dialyse trinnet er valgfritt. Ikke desto mindre har dialyse tre fordeler: det reduserer mengden av HCl som er nødvendig for utfellingen, den forbedrer syre masseoverføring i ekstraktet og senker askeinnholdet i det oppnådde ALE. For utfelling av ALE anbefales det å bruke et glassbeger med et mye større volum enn extract. Na 2 CO 3 er normalt overdosert i utvinning. Den tilsatte HCl vil først reagere med Na 2 CO 3 venstre i ekstraktet, hvilket resulterer i karbondioksyd dannelse og, dersom prøven ikke ble dialysert før, i skumming. Under tilsetningen av HCl, bør ekstraktet røres langsomt med en magnetisk rørestav av samme størrelse som i bunnen av begerglasset. En rørestav av denne størrelse og langsom omrøring vil resultere i selv å blande uten å bryte strukturen av bunnfallet. Hvis sure gel-klumper dannes i ekstrakten, bør begerglasset blir virvlet svakt for hånd. Utfellingen gjennomføres med en syrekonsentrasjon på 1 M til å unngå en stor volumøkning av ekstraktet, mens det fremdeles oppnås en homogen fordeling av syren i prøven. Høyere syrekonsentrasjoner kan resultere i en regional pH reduksjon og sure gel klumper formasjon. En pH lavere enn 2,0 reduserer mengden ALE som kan utvinnes, sannsynligvis på grunn av strukturelle endringerav polymerene ved lavere pH. Det er derfor viktig å holde den endelige pH-verdi på 2,20 ± 0,05.
begrensninger
Den ALE utvinning metoden tar sikte på å trekke strukturelle ekstracellulære polymerer av EPS fra AGS eller biofilm generelt og er ikke ment å trekke ut alle nåværende EPS. For å trekke ut alle EPS, er det nødvendig med en kombinasjon av mer enn én utvinningsmetoden. Dessuten, som vist med økningen av VS EPS utbyttet ved å bruke en dobbel og firedoble utvinning, en enkelt utvinning vil ikke trekke ut alle strukturelle EPS. ALE utvinning er en hard EPS utvinning metode som kombinerer konstant blanding med varme og alkaliske forhold. Av denne grunn er det mulig at noe intracellulært materiale ekstraheres sammen med EPS. Selv om cellelyse kan være forårsaket av fysiske og kjemiske utvinning teknikker (ultralyd 31,32, NaOH 31,32, EDTA 11,32, CER 32, varme 32 og høy skjærhastigheter ved mblanding 19), trenger fortsatt tilstedeværelse av intracellulært materiale i gjenvinnes EPS som skal verifiseres. Den ioniske gel dannende tilhører de utpakkede EPS er hovedfokus for denne forskningen, om gjenvunnet EPS inneholder intracellulært materiale ble ikke analysert. Fremtidig forskning vil fokusere på å identifisere intracellulært materiale i de utpakkede EPS.
Solubiliserende hydrogelen matrise av AGS er avgjørende for å trekke ut strukturelle EPS
EPS danner en tett og kompakt hydrogel matrise i AGS. Selv om EPS inneholder forskjellige klasser av organiske makromolekyler så som polysakkarider, proteiner, nukleinsyrer, (fosfo) lipider, humusstoffer og noen intercellulære polymerer 7,5,8, ikke alle av dem danner en gel. Bare de gel-dannende polymerer er her betraktet som strukturelle polymerer i EPS.
Formålet med EPS ekstraksjoner er først å oppløse EPS, og deretter å samle solubiliserte EPS. Dersom de strukturelle EPS (dvs. than EPS danne en hydrogel) er målet for ekstraksjonen, har den gel-matrise av AGS for å bli oppløst først. Eneste metoder som kan oppløse den gel-matrisen er i stand til å utvinne strukturelle EPS. I denne forskningen, noen brukte EPS utvinning metoder som sentrifugering 10 – 15, ultralyd 10,14,15, EDTA 10 – 12,14,15, formaldehyd + NaOH 10 – 15 og formamide + NaOH 13 ikke kan effektivt isolere den strukturelle EPS. Dette skyldes det faktum at hydrogelen matrise av aerobe granuler ble ikke solubilisert ved hjelp av disse metodene. Av denne grunn ble stabilitetstester i § 4 bare utføres med forholdene til stede i EDTA, formamide + NaOH og formaldehyd + NaOH utvinning. Disse tre ekstraksjoner var ikke i stand til å isolere strukturelle EPS, men likevel oppnås det høyeste utbytte VS EPS foruten Na 2 CO 3 ekstraksjon. forhold of Na 2 CO 3 uttrekking ikke ble påført, da dette utvinning metoden klart oppløst AGS matrisen. Derav de anvendte forholdene under stabilitetstesten ble ansett representant.
Ekstraksjon med kationbytterharpiks (CER), en annen hyppig brukt EPS utvinning metoden, ble ikke ansett for denne sammenligningen, som tidligere studier på EPS ekstraksjon med CER ikke ga bedre resultater enn de kjemiske utdrag brukt her.
Gel-dannende EPS i AGS
Gel-dannende EPS er ansett som de strukturelle EPS i hydrogelmatriks av AGS. Det er verdt å påpeke at det finnes ulike typer hydrogeler som ioniske geler, temperaturinduserte gels og pH indusert gels. Denne studien fokuserer bare på EPS som danner ioniske geler. Når det gjelder stor fraksjon av strukturell gelmateriale trukket ut, er dette sannsynligvis vil være dominerende strukturelle EPS. Det er absolutt muligheter for at andre typer EPSsom danner forskjellige typer hydrogeler (for eksempel pH-induserte gel 28) foreligger i det samme eller andre typer aerobe granuler. Likevel, uansett hva slags hydrogel er målrettet, oppløsende EPS gel matrix er det viktigste steget for å trekke gel-forming EPS.
Foreløpig har lite forskning er gjort på strukturelle EPS på kornet slam. Den ALE ekstraksjon som er beskrevet i denne protokollen er i stand til å trekke ut geldannende EPS fra AGS og vil bli benyttet i fremtidige studier for å karakterisere strukturelle EPS. Mer forskning må gjøres på AGS, strukturelle EPS og ikke-strukturelle EPS for å bedre forstå prosessen og funksjon av korning og EPS. Spesielt de følgende tre punkter må undersøkes: hvorfor mikroorganismer fremstille en så stor mengde av EPS, hva som er den nøyaktige sammensetning av EPS, og hvor sammensetningen av EPS endres avhengig av miljøendringer. Oppdage og analysere alle involverte forbindelser og deres interaktivons vil bidra til å forstå biofilmer og hvordan du bruker dem til vår fordel.
The authors have nothing to disclose.
This research was financially supported by the SIAM Gravitation Grant 024.002.002, the Netherlands Organization for Scientific Research and by the Dutch Technology Foundation (STW – Simon Stevin Meester 2013). The authors want to thank Mario Pronk for providing the granular sludge samples.
250 ml baffled flask | Kimble | 25630-250 | |
1000 ml glass beaker | VWR | 213-1128 | |
RCT basic, magnetic stirrer with thermometer | IKA | 3810000 | |
sodium carbonate decahydrate | Merck KGaA | 1063911000 | |
50 ml centrifugation tubes | greiner bio-one | 227261 | |
Multifuge 1 S-R, centrifuge | Heraeus/Thermo Scientific | – | |
hydrochloric acid, 37 % | Sigma-Aldrich | 30721-1L-GL-D | |
250 ml glass beaker | VWR | 213-1124 | |
calcium chloride dihydrate | Merck KGaA | 1023821000 | |
1 ml Pasteur Pipette | Copan | 201C |