Protokollet ger en metod för att lösa aerob granulärt slam i syfte att utvinna alginat liknande extracellulära polymerer (ALE).
To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na2CO3) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca2+). From the six extraction methods used, only the Na2CO3 extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca2+. The Ca2+-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.
Under de senaste åren aeroba granulärt slam (AGS) processen har blivit en populär biologisk avloppsrening process, med framgång tillämpas på flera avloppsreningsverk fullskaleanläggningar 1. I motsats till det konventionella aktivslamprocessen, i AGS behandla mikroorganismerna bildning av granuler istället för flockarna 2. Dessa granuler har bättre sedimente, klarar högre organisk last priser, och har högre tolerans mot toxicitet än aktivslam flockar 3.
Till skillnad från biofilmer, är AGS bildas spontant utan inblandning av någon bärarmaterial 4. I AGS, liksom i biofilmer, mikroorganismer producerar en betydande mängd av höggradigt hydratiserade extracellulära polymera substanser (EPS) 5 för att bilda en hydrogel matris där de är själv immobiliserad 4-6. EPS är en komplex blandning, som består av polysackarider, proteiner, nukleinsyror, (phospho) lipider, humusämnen och vissa interpolymerer 5,7,8. Dessa polymera ämnen interagerar med varandra via elektrostatiska krafter, vätebindningar, attraktiva joniska krafter och / eller biokemiska reaktioner, etc. 5, som bildar en tät och kompakt tertiär nätverksstruktur. Polymererna i EPS som kan bilda hydrogeler 4,9 och bidra till bildandet av den tertiära nätverksstrukturen är i detta avseende betraktas som strukturella EPS, en delmängd av den totala EPS.
EPS är ansvariga för den kemiska strukturen och de fysikaliska egenskaperna hos granulat 5. Det är därför viktigt att förstå funktionen hos varje EPS förening. Olika metoder används för att extrahera EPS 10-15. Men på grund av att de är extremt komplicerade, är det nästan omöjligt att extrahera alla EPS komponenter genom en enda metod. Hittills finns det ingen "one size fits all" metod för EPS utvinning. Valet av extraktionsmetod påverkar inte bara den totala mängden, men också sammansättningen av de återvunna polymerer 13,16 – 20. Beroende på vilken typ av slam och EPS intressanta olika metoder krävs.
Extrahera gelbildande polymerer, som kännetecknar deras egenskaper och undersöka deras interaktioner med varandra och med icke-gelbildande EPS kommer att bidra till att avslöja roll EPS i aerob formation granulärt slam. Vidare är de gelbildande polymererna är också användbara biopolymerer i industriella tillämpningar. En möjlig tillämpning var redan visats genom användning av gelbildande polymerer från AGS som ett beläggningsmaterial för att öka vattenbeständigheten hos papper 21.
Därför behövs extraktionsmetoder, specifika för gelbildande EPS. Syftet med denna studie är att utveckla en metod för att utvinna gelbildande EPS från AGS. Sex extraktionsmetoder 10-15,22, som ofta används i litteraturen, valdes för att extrahera EPS från AGS. Det totala beloppet och gelbildande egenskap hos de extraherade EPS jämfördes för varje metod.
Anmärkningar för protokollenheten
Extraktionen av EPS / ALE beskrivs för en volym av 50 ml och 3 g granulat. Dessa värden är avsedda som riktlinjer. Extraktioner med högre granulat koncentrationer kan minska utbytet av de extraherade EPS. Vid utvinning av ALE temperaturen bör hållas konstant vid 80 ° C under 30 min. Den tid som krävs för blandningen att värma upp (ca 5 min) är inkluderad i det protokollet. Vidare är extraktion effektivitet förbättras genom användning av en magnetisk omrörarstav av samma storlek som diametern för kolvens botten. Detta kommer att resultera i goda blandningsegenskaper och fräseffekter, främja extraktionen av EPS.
Senare i protokollet avsnittet är TS och VS utbyten av alla extraktioner (supernatant i steg 1,1-1,6) bestäms. Dialys måste utföras före TS och VS mätning för att minska eventuella fel på grund av förekomsten av kemikalier som används för extraktioner. enMWCO av 3500 Da rekommenderas att ta bort dessa kemikalier med bibehållen EPS makromolekyler inom dialyspåsen. Dialyspåsen bör ha en större volym än volymen av extraktet. Detta är nödvändigt, eftersom volymen av extraktet kommer att öka under dialys (t.ex. för EDTA utvinning upp till 40% volymökning). Omfattningen av kemisk avlägsnande genom dialys kan bestämmas genom mätning av pH i provet före och efter dialys. Alternativt konduktivitetsmätningar av dialys vatten visar omfattningen av jon borttagning.
För att erhålla ALE från den totala extraherade EPS (steg 1,6 och 2) dialys steg är valfritt. Icke desto mindre har dialys tre fördelar: det reducerar mängden av HCl behövs för utfällningen, det förbättrar syramassöverföring i extraktet och minskar innehållet i den erhållna ALE aska. För utfällning av ALE rekommenderas att använda en glasbägare med en mycket större volym än extract. Na 2 CO 3 normalt doseras i utvinning. Den sattes HCl kommer först reagera med Na 2 CO 3 kvar i extraktet, vilket resulterar i koldioxid bildning och, om provet inte dialyserades tidigare, i skumning. Under tillsatsen av HCl, bör extraktet omröras långsamt med en magnetisk omrörarstav av samma storlek som botten av bägaren. En omrörarstav av denna storlek och långsam omrörning kommer att resultera i jämn blandning utan att bryta strukturen hos fällningen. Om sura gel klumpar bildas i extraktet bör bägaren snurras lätt för hand. Utfällningen hålls med en syrakoncentration av 1 M för att undvika ett stort volymökning av extraktet medan man fortfarande erhåller en homogen fördelning av syran i provet. Högre syrakoncentrationer kan leda till en regional pH-sänkning och sura gel klumpar bildas. Ett pH lägre än 2,0 minskar mängden ALE som kan återvinnas, förmodligen på grund av strukturella förändringarav polymererna vid lägre pH. Det är därför viktigt att hålla den slutliga pH-värdet vid 2,20 ± 0,05.
begränsningar
ALE utvinning Metoden syftar till att utvinna strukturella extracellulära polymerer av EPS från AGS eller biofilmer i allmänhet och är inte avsedd att extrahera alla nuvarande EPS. För att extrahera alla EPS, är det nödvändigt med en kombination av mer än en extraktionsmetod. Dessutom, som visas med ökningen av VS EPS avkastning genom att tillämpa en dubbel och fyrdubbla utvinning, en enda extraktion kommer inte extrahera alla strukturella EPS. ALE extraktion är en hård EPS extraktionsmetod, kombinerar konstant blandning med värme och alkaliska betingelser. Av denna anledning är det möjligt att en del intracellulärt material extraheras tillsammans med EPS. Även cellys kan orsakas av fysiska och kemiska utvinningstekniker (ultraljudsbehandling 31,32, NaOH 31,32, EDTA 11,32, CER 32, värme 32 och hög skjuvhastigheter av mixing 19), måste närvaron av intracellulära material i återvunna EPS står att verifieras. Den joniska gelbildande egenskap hos de extraherade EPS är i fokus för denna forskning, om den återvunna EPS innehåller intracellulär material analyserades inte. Framtida forskning kommer att fokusera på att identifiera intracellulära materialet i de extraherade EPS.
Solubilisering hydrogelmatrisen AGS är avgörande för att utvinna strukturella EPS
EPS bildar en tät och kompakt hydrogel matris i AGS. Även om EPS innehåller olika klasser av organiska makromolekyler, såsom polysackarider, proteiner, nukleinsyror, (fosfo) lipider, humusämnen och vissa intercellulära polymerer 7,5,8, inte alla av dem bilda en gel. Endast de gelbildande polymerer här betraktas som strukturella polymerer i EPS.
Syftet med EPS extraktioner är att först lösa EPS och sedan samla de solubiliserade EPS. Om de strukturella EPS (dvs than EPS bildar en hydrogel) är målet för utvinning, har gelmatrisen av AGS som skall lösas först. Endast metoder som kan solubilisera gelmatrisen är kapabla att utvinna strukturella EPS. I denna forskning används EPS extraktionsmetoder såsom centrifugering 10 några vanliga – 15, sonikering 10,14,15, EDTA 10 – 12,14,15, formaldehyd + NaOH 10 – 15 och formamid + NaOH 13 kunde inte på ett effektivt sätt isolera strukturella EPS. Detta beror på det faktum att hydrogel-matrisen av de aeroba granulerna inte solubiliserades genom dessa metoder. Av denna anledning har stabilitetstester i avsnitt 4 endast utföras med omständigheterna i EDTA, formamid + NaOH och formaldehyd + NaOH extraktion. Dessa tre extraktioner var inte i stånd att isolera strukturella EPS, men ändå fått högsta VS EPS avkastning förutom Na 2 CO 3 extraktion. betingelser of Na 2 CO 3 extraktion har inte tillämpats som denna extraktionsmetod klart solubiliserade AGS matrisen. Därav de tillämpade förhållandena under stabilitetstestet ansågs vara representativa.
Extraktion med katjonbytarharts (CER), en annan ofta använd EPS extraktionsmetod, ansågs inte vara för denna jämförelse, som tidigare studier på EPS extraktion med CER inte gav bättre resultat än de kemiska extraktioner används här.
Gelbildande EPS i AGS
Gelbildande EPS betraktas som struktur EPS i hydrogel matris av AGS. Det är värt att påpeka att det finns olika typer av hydrogeler, såsom joniska geler, temperatur inducerade geler och pH inducerade geler. Denna studie fokuserar bara på EPS som bildar joniska geler. Beträffande stor del av struktur gelmaterial utvinns, är detta sannolikt att vara de dominerande strukturella EPS. Det finns säkert möjligheter som andra typer av EPSsom bildar olika typer av hydrogeler (t.ex. pH inducerade gel 28) finns i samma eller annan typ av aeroba granuler. Ändå, oavsett vilken typ av hydrogel är riktad, solubilisering EPS gelmatrisen är det viktigaste steget för att extrahera gelbildande EPS.
För närvarande har lite forskning gjorts på strukturella EPS granulärt slam. ALE extraktion beskrivs i detta protokoll är kapabel att extrahera gelbildande EPS från AGS och kommer att användas i framtida studier för att karakterisera struktur EPS. Mer forskning behöver göras på AGS, strukturella EPS och icke-strukturella EPS för att bättre förstå processen och funktion granulering och EPS. Särskilt följande tre punkter måste utredas: varför mikroorganismer producerar en så stor mängd av EPS, vad är den exakta sammansättningen av EPS och hur sammansättningen av EPS ändras beroende på miljöförändringar. Upptäcka och analysera alla berörda föreningar och deras interactions kommer att bidra till att förstå biofilmer och hur man använder dem till vår fördel.
The authors have nothing to disclose.
This research was financially supported by the SIAM Gravitation Grant 024.002.002, the Netherlands Organization for Scientific Research and by the Dutch Technology Foundation (STW – Simon Stevin Meester 2013). The authors want to thank Mario Pronk for providing the granular sludge samples.
250 ml baffled flask | Kimble | 25630-250 | |
1000 ml glass beaker | VWR | 213-1128 | |
RCT basic, magnetic stirrer with thermometer | IKA | 3810000 | |
sodium carbonate decahydrate | Merck KGaA | 1063911000 | |
50 ml centrifugation tubes | greiner bio-one | 227261 | |
Multifuge 1 S-R, centrifuge | Heraeus/Thermo Scientific | – | |
hydrochloric acid, 37 % | Sigma-Aldrich | 30721-1L-GL-D | |
250 ml glass beaker | VWR | 213-1124 | |
calcium chloride dihydrate | Merck KGaA | 1023821000 | |
1 ml Pasteur Pipette | Copan | 201C |