ספירלת גנגליון Neuron explant תרבות Electrophysiology על מערכי אלקטרודה רבות
Summary
We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.
Abstract
Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons.
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.
Introduction
In accordance with the World Health Organization, 360 million people worldwide suffer from hearing loss with profound consequences on professional and private life. Hearing aids can restore sensory function in moderate forms of hearing loss; however, for the most severe cases, the most effective treatment option is a prosthetic device called a cochlear implant (CI). CIs contain a linear electrode array of up to 24 electrodes, which is surgically inserted into the scala tympani of the cochlea. The electrodes directly stimulate the spiral ganglion neurons, forming the auditory nerve 1.
With more than 300,000 devices implanted worldwide, CIs are very successful medical implants and rank among the most cost-effective procedure ever reported. Despite its success the cochlear implant still has limitations such as reduced frequency resolution compared to physiological hearing. This can lead to deficits in effective communication in groups or noisy environments, and the ability to decipher very complex sounds such as music. This reduced frequency resolution is likely due to the gap between the CI electrodes and the spiral ganglion neurons, leading to stimulation of large groups of neurons. This gap is in the range of hundreds of micrometers 2,3. Elimination of this gap would facilitate the stimulation of smaller groups of neurons per electrode, thereby increasing frequency resolution and overall performance of the device 4.
To study the influence of the gap between the electrode and the neuron and the effect of various optimized stimulation protocols, we have developed an in vitro bioassay based on a non-invasive electrophysiological characterization of SGNs on multi electrode arrays (MEAs) 5. Additionally, MEAs can be easily modified to vary electrode shape, size, material and surface roughness, to optimize the neuron-electrode interface. The following is a step-by-step protocol to reproducibly obtain recordings from murine spiral ganglion neuron cultures and assess the dependency on the above-mentioned parameters.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מראה כיצד תרבות explants SGN על MEA ולהעריך פעילות SGN ידי הקלטות תאיות לא פולשנית. פלטפורמה זו והפרוטוקול שפתחנו לאחרונה 5 לאפשר זיהוי של פרוטוקולי גירוי רומן וחומרים אלקטרודה שמניבים דרישות אנרגיה מופחתות להפעיל SGN, עם ריבית פוטנציאל מימוש נוסף של שתלי שבלול ו-תותבות נוירו אחרות. אמצעי זהירות מספר הנוהל שהוצג הם יסוד עבור ההישג של ניסויים מדויקים לשחזור.
דיסקציה הזהירה של הגנגליון הספירלה לטיפולה של הרקמה העיקרית מחייבת זהירות מיוחדת. ניסויים אלה בוצעו באמצעות עכברים C57 / BL6 בין 5 ל 7 ימים. תוצאות דומות התקבלו באמצעות חולדות Wistar באותו טווח גילאים, (מידע לא מוצג). אנו מאמינים כי זהו הגיל הטוב ביותר עבור לנתיחת קנס כמו עצם השבלול הוא עדיין רך enough להסרה קלה בעזרת מלקחיים, ואת הגנגליון ספירלה האיבר של קורטי ניתן להפריד בקלות ללא פקיעת תהליכים דנדריט או somas SGN. בגילים מוקדמים יותר הרקמה היא רכה מדי והסיכויים לקרוע את SGN somas יחד עם האיבר של קורטי הוא גבוה, בעוד בשלבים מאוחר יותר, ההתקשות של הקפסולה הגרמי של השבלול מעלה את הסיכון של פגיעה ברקמה תוך ביתור. בידוד נכון של SG כמו גם חיתוך זהיר של explants הוא קריטי. אלה צריכים להיות בטווח של 200-500 מיקרומטר בגודל למקסם מצורף אל פני השטח MEA וכדי יש מספר מספיק של SG somas ב explants, שממנו neurites יחל לצמוח מחדש. כדי להגביר את התמיכה נוירוטרופי בימים הראשונים של תרבות, BDNF הטרי מתווסף יומי ואת האיבר של קורטי מושם שיתוף תרבות.
המהירות לנתיחה היא גם חשובה. כל הצעדים צריכות להתבצע במהירות באמצעות פתרונות קרים קרח כדי למזער הידרדרות רקמה. הזמן בין המתת חסד הצבת explant על MEA צריך להיות בין 10-15 דקות והיא חיונית עבור תרבויות מוצלחות. יש את כל הכלים מוכנים, כדי למנוע עיכובים ציפוי תרבות.
כל השלבים, כוללים לנתיחת קנס, תחזוקה של התרבות והכנה בינוני וציוד מבוצעים בתנאים סטריליים. כאשר ציפוי MEA עם פתרון ECM חשוב להפשיר אותו על קרח ולהשתמש טיפים פיפטה קר כקרח ובינוני קר כקרח כמו ג'לים ECM התמהיל בטמפרטורות גבוהות. כאשר נחת explants על MEAs, ראשון להוסיף מדיום לאזורי אלקטרודה, ובהמשך למקם את explants. אם המדיום הוא הוסיף בשלב שני, explants נוטה להתנתק MEA בשל גז מתח. בגלל כמויות קטנות של מדיום מוחלות על התרבות ב 5 ימים ראשונים, אידוי של מדיום התרבות צריך להיות ממוזער. לכן מומלץ מאוד כדי ליצור תא humidified על ידי צלחות פטרי קטנות המכילות PBS ב Proxim הקרובity אל MEAs.
הניסויים שתוארו כאן בוצעו באמצעות אלקטרודות MEA זמינות מסחרי עם ממדים אלקטרודה ספציפית, חומרי ציפוי ומרחק אלקטרודה תוך (כמתואר בסעיף 2 קטנים, הערה). תנאי תרבות מוטבו כאן כדי למקסם את הכיסוי עצבי של עיצוב רשת אלקטרודה הספציפי. יתכן כי בתצורות אחרות של מרווח אלקטרודה, גיאומטריות ומשטחים עשויות לדרוש ציפויים שונים או צפיפות תא. צעדים אלה עשויים לדרוש פתרון בעיות ראשוניות על מנת להשיג תרבויות בצפיפות גבוהה.
בדבר הקלטות אלקטרו, לפני תחילת הקלטות התרבות מועברת ממדיום התרבות ב 37 ° C עד פתרון תאי ב RT. על מנת להימנע הקלטות יציבות, לחכות כ 10 דקות כדי לאפשר התרבות לייצב. כאשר מגרה את התרבות, זהירות מסוימת יש להשתמש בבחירת הגירויאמפליטודות גדול כמו (> 3 V) ו משכי עלול לגרום נזק התרבות. לקבלת הפניה לגבי צורות דופק גירוי ומשך ראה התייחסות 5.
לרכישת נתונים וחומרת תוצרת בית עיבוד (תא הקלטה, חיבורי המגברים והמגברים) שמשו ותוכניות ניתוח ספציפיות נבחרו (ראה טבלת חומר, נקודת 7). עם זאת, הגדרות MEA המסחרית אחרות חבילות תוכנה אחרות המתאימים כמו גם עבור פעולות אלה. הערכנו בעבר התגובות של תרבותנו ב -3 נקודות זמן שונות והראיתי פעילות מוגברת עם זמן תרבות הממושכת 5. כאן אנו מציעים 18 ימים במבחנה להקלטות. מערכות MEA המאפשרות הקלטות רציפות בתאי סטרילי, humidified, יכולות להקל על זיהוי של נקודות הזמן האופטימליות לכל סוג התרבות.
חסרון עיקרי של המבדק הזה הוא הווריאציה הגבוהה ב tהוא מספר אלקטרודות לכל תרבות המראה תגובות לגירויים. שיעור זה של תגובות לגירויים בעיקר תלוי ארבעה גורמים: הצפיפות של neurites בתרבות, המגעים בין neurites ואת אלקטרודות, הקוטר של neurites או צרורות neurites, ואת העכבה של האלקטרודות. לגבי צפיפות neurite, רק neurites הגדלים על פני לפחות שתי אלקטרודות יכול לשמש בניסויים גירוי. הקשר בין neurites ואלקטרודות תלוי הרקמה שמסביב שיכול מחד לבודד את neurites מן האלקטרודה, ובכך להחמיר את הקשר, או, מצד שני, לבודד את neurites לבין אלקטרודה מהאמבטיה שמסביב ובכך לשפר איש הקשר. צפיפות רקמה, כמו גם גודל neurite, מוגדרת על ידי explant המשמש ואת תנאי התרבות. תרבויות עצביות ניתקו גם נבדקו בהצלחה אבל צפיפות עצבית בתרבויות אלה היא נמוכה בהרבה, וכתוצאה מכך מספר מופחת של recoאלקטרודות rding. לכן תרבות התא צריכה להיות מותאמת לשאלה המדעית הספציפית לטפל.
לבסוף, העכבה של אלקטרודות ניתנת בעיקר על ידי גודל השטח של אלקטרודות. חומרים, יצירת משטח גדול כגון פלטינה שחורה, כפי שמוצג באיור 3, ומקטין את העכבה של אלקטרודות עשוי גם לשפר את הצימוד בין אלקטרודות neurites 7-9.
אסטרטגיות כדי לשפר את שיעור ההצלחה של גירוי ולכן כוללים אופטימיזציה של תנאי התרבות, העלייה של מספר אלקטרודות מוחלט או צפיפות האלקטרודות ואת אפנון של פני האלקטרודה 10.
עד כה, אפיון אלקטרו של נוירונים SG נעשה תוך שימוש בטכניקות מהדק תיקון. זה מאפשר הקלטות תאיות של פוטנציאל פעולה וניתוח מפורט של זרמים יוניים תאיים מנוירונים בודדים. כאן אנו מציגים מבדק במבחנה, שניתן להשתמש בם כדי ללמוד פרופילי פעילות של נוירונים גנגליון ספירלה באמצעות ניתוח פעילות ספונטנית או תגובות לגירויים תאיים של נוירונים רבים בו זמנית. בנוסף, האינטראקציה בין האלקטרודה נוירונים גנגליון ספירלה ניתן ללמוד אופטימיזציה על ידי יישום של חומרים מהונדסים או חדש. לבסוף, גם אם לא מוצג כאן, פלטפורמה זו ניתן להשתמש בשילוב עם אלקטרודה חיצוני, רכוב על micromanipulator כמוצג לאחרונה על ידי הקבוצה שלנו 5, על מנת ללמוד את הקשר בין המרחק של פעילות אלקטרודה ותרבות מגרה. כל היבטי רומן אלה מאפשרים החיקוי של תכונות עיקריות של אלקטרודות שתלו שבלול עשוי להוביל את העיצוב של תותבי רומן.
המודל שלנו הוא מאוד שימושי בכלי במבחנה לחקור אסטרטגיות כדי לשפר את היעילות של גירוי של נוירונים שמיעתיים אופ נוספתטכנולוגית CI timize. לאחר הטכניקה שולטת, אפשר לדמיין הקרנה עבור שינוי של מספר משתנה: א) אוכלוסיות נוירונים שונות, ב) אלקטרודה חומרים שונות / גודל / עכבות ג) לבצע ניסויים כרוניים לבדוק רעילויות חומר או האלקטרודה גירוי רעילות מושרה, אשר יכול לשפוך אור על פרוטוקולי גירוי בטוחים ויעילים יותר על ידי מערכי אלקטרודות in vivo.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים רות Rubli במחלקה לפיזיולוגיה של אוניברסיטת ברן, שוויץ לעזרה טכנית יקר עם הניסויים. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי התוכנית של האיחוד האירופי FP7-NMP (הסכם מענק לא 281,056; פרויקט NANOCI – www.nanoci.org.).
Materials
| culture medium | |||
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | 24 ml (for 25 ml) |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | 250 μl (for 25 ml) |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | 250 μl (for 25 ml) |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 500 μl (for 25 ml) |
| FBS | GIBCO | 10099-141 | 10% (for 25 ml) |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025/CF | final 5 ng/ml (for 25 ml) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| extracellular solution (pH 7.4) | |||
| NaCl | 145mM | ||
| KCl | 4mM | ||
| MgCl2 | 1mM | ||
| CaCl2 | 2mM | ||
| HEPES | 5mM | ||
| Na-pyruvate | 2mM | ||
| Glucose | 5mM | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blocking solution | |||
| PBS | Invitrogen | 10010023 | |
| BSA | Sigma | A4503-50G | 2% |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | 0.01% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| TuJ | R&D Systems | MAB1195 | dil 1:200 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Fluoreshild | Sigma | F6057 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plastic/tools | |||
| petri dish 35 mm | Huberlab | 7.627 102 | |
| petri dish 94 mm | Huberlab | 7.633 180 | |
| Dumont #5 tweezer | WPI | 14098 | |
| Dumont #55 tweezer | WPI | 14099 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Enzymatic solution: Terg-a-Zyme | Sigma | Z273287-11KG | |
| Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM | Corning | 356230 | |
| MEA electrodes | Qwane Biosciences | (Lausanne, Switzerland) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Labview | National Instruments | Switzerland | |
| IgorPro | WaveMetrics | Lake Oswega, USA |
Referências
- O’Donoghue, G. Cochlear implants–science, serendipity, and success. N Engl J Med. 369 (13), 1190-1193 (2013).
- Shepherd, R. K., Hatsushika, S., Clark, G. M. Electrical stimulation of the auditory nerve: the effect of electrode position on neural excitation. Hear Res. 66 (1), 108-120 (1993).
- Tykocinski, M., et al. Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays. Am J Otol. 21 (2), 205-211 (2000).
- Wilson, B. S., Dorman, M. F. Cochlear implants: current designs and future possibilities. J Rehabil Res Dev. 45 (5), 695-730 (2008).
- Hahnewald, S., et al. Response profiles of murine spiral ganglion neurons on multi-electrode arrays. J. Neural Eng. 13, (2015).
- Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).
- Heim, M., Yvert, B., Kuhn, A. Nanostructuration strategies to enhance microelectrode array (MEA) performance for neuronal recording and stimulation. J Physiol Paris. 106 (3-4), 137-145 (2012).
- Kim, R., Nam, Y. Novel platinum black electroplating technique improving mechanical stability. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 184-187 (2013).
- Cellot, G., et al. Carbon nanotubes might improve neuronal performance by favouring electrical shortcuts. Nat Nanotechnol. 4 (2), 126-133 (2009).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat Nano. 8 (2), 83-94 (2013).
