생성 및 당뇨병 치유 하는 부상을 모델에서 줄기 세포 지방이 많은 파생 (ASC) 시트의 이식
Summary
지방 유래 줄기 세포 (ASCs) 쉽게 격리 하 고 정상 쥐의 지방에서 수확. ASC 시트 셀 시트 엔지니어링을 사용 하 여 만들 수 있습니다 하 고 주 커 전체 두께 전시 하는 당뇨 지방 쥐 결함 노출 된 뼈와 피부와 다음 인공 피부의 bilayer 덮여에 이식 될 수 있다.
Abstract
인공 피부는 임상 연습에 상당한 치료 결과 달성 했다. 그러나, 당뇨병 환자 비능률적된 혈 또는 큰 상처와 상처에 대 한 인공 피부 치료 연장 될 수 있습니다. 세포 기반 치료 당뇨병 궤 양의 치료에 대 한 새로운 기술로 등장 하 고 셀 시트 공학 세포 이식의 효능을 향상 했다. 보고서의 수는 지방 유래 줄기 세포 (ASCs), 중간 엽 기질 세포 (MSC), 유형의 지방 조직 및 다른 조직에서 MSCs에 비교 될 때 컬렉션에 대 한 그들의 접근에서 그들의 관계 되는 풍부 때문에 치료 잠재력을 전시 하는 건의 했다. 따라서, ASCs 치료 용 줄기 세포의 좋은 원천이 될 나타납니다. 이 연구에서는 일반 루이스 쥐의 epididymal 지방 지방에서 ASC 시트 온도 응답 문화 요리와 의약품을 포함 하는 일반 문화 매체를 사용 하 여 성공적으로 창조 되었다. ASC 시트 커 당뇨병 지방산 (ZDF) 쥐에 이식 했다의 저하는 비만 2 형 당뇨병 쥐 모델 상처 치유. 상처 후부 두개골 표면에 만들어진, ASC 시트는 상처에 이식 했다 그리고 bilayer 인공 피부는 시트 커버를 사용 되었다. 받은 ASC 시트에서 쥐에서 쥐 ASC 시트 이식 없이 보다 치유 상처 더 했다. ASC 시트는 습 한 상처 환경 유지 보수를 필요로 건조 조건에 과민 하기 때문에이 접근은 제한 되었다. 따라서, 인공 피부 건조를 방지 하는 ASC 시트 커버를 사용 되었다. 인공 피부와 함께에서 ASC 시트 allogenic 이식 또한 다른 다루기 힘든 궤 양이나 화상, 말 초 동맥 질환 및 교원 질 질병, 관찰 등을 적용할 수 있습니다 그리고는 영양 또는 스테로이드를 사용 하는 환자에 게 관리 될 수 있습니다. 따라서,이 치료는 당뇨병 상처 치유에 대 한 치료 옵션을 개선 향한 첫 번째 단계를 수 있습니다.
Introduction
당뇨병 환자의 인구 세계 전반 증가 하 고 20151;에서 400 백만 도달 당뇨병 환자의 약된 15-25% 더 낮은 말단 당뇨병 궤 양2의 진행에서 위험에 있습니다. 더 낮은 말단 당뇨병 궤 세공 되지 않으며 완전 한 회복 후 재활 훈련으로 장기간 치료를 해야 할 수도 있습니다. 긴 치료 기간을 종종 환자 삶의 질에 있는 뜻깊은 감소에 있는 결과. 따라서, 당뇨병 상처 치료에 대 한 감소 또는 악화를 방지 하는 새로운 치료를 개발 해야 합니다. 당뇨병 상처 치유를 평가 하려면 우리는 당뇨 궤 양 상처 치유 모델 쥐, 모방 실용적인 임상 조건, 최적화 그리고 치유 상처 가속 지방 유래 줄기 세포 (ASC) 시트 셀 시트 엔지니어링을 사용 하 여 이식 여부 평가.
Mesenchymal stromal 세포 (MSCs) 그들의 자기 갱신, 그들의 immunomodulatory 효과 용량과 다양 한 세포 계보3으로 차별 하는 그들의 능력 때문에 상처 치유를 가속을 위한 우수한 잠재력을 전시. ASCs는 지방 조직에서 파생 된 MSC의 유형 그리고 그들은 그들의 잠재적인 신생 및 paracrine 활동4,5를 포함 하 여 다른 조직에서 파생 된 MSCs에 몇몇 이점을 전시. 지방 조직, 인체에서 상대적으로 풍부한 이며 최소한 침략 적 절차를 사용 하 여 컬렉션에 대 한 접근 허용. 따라서, ASCs 상처 치유 응용 프로그램6,7에 대 한 실험적으로 사용 되었습니다.
이전 보고서 상처 주변 지역에 단일 셀 MSC 정지 직접 주입 상처 치유8,9를 가속화할 수 있습니다 나타났습니다. 그러나,이 당뇨병 궤 양 모델 단일 세포 현 탁 액의 주입에 따라 상처 치유의 가속의 보고서에도 불구 하 고 상처 사이트에서 이식된 세포의 생존에 명확 하지 않습니다.
이 연구에서 우리가 온도 응답 문화 요리를 사용 하 여 셀 시트 공학 적용. 이 요리는 온도 응답성 고분자 N-isopropylacrylamide covalently 그들의 표면10에 바인딩된. 이식할된 폴리머 레이어를 온도-제어 세포 접착 또는 문화 접시의 표면에서 분리 수 있습니다. 접시의 표면이 된다 37 ° C에서, 반면 세포 표면에서 32 ° c 온도에서 친수성이 되 면 저절로 분리 준수 및 증식, 세포 수 소수 배양된 세포 온도; 감소 하면 그대로 셀 접합 및 세포 외 매트릭스 (ECMs)와 인접 셀 시트 수확 수 있습니다. 따라서, ECM, 트립 신, 등을 손상 하는 분해 효소 필요11않습니다. 따라서, 셀-시트 공학 셀 연결을 유지 하 고 세포 이식의 효능을 향상 시킬 수 있습니다.
또한, 셀-시트 이식 세포 주입12에 비교 될 때 세포 생존 율을 증가 시킵니다. 이 프로토콜에서 커 당뇨 지방 (ZDF) 쥐 지연된 상처 치유와 타입 2 당뇨병과 비만 모델 선정 됐다. 쥐 자발적으로 약 4 주에 비만 개발합니다. 그들은 다음 어느 시점에서 그들은 혈당 인슐린 저항, dyslipidemia, 그리고 hypertriglyceridemia13과 관련 된 전시 하는 나이의 8과 12 주 사이 비만과 2 형 당뇨병을 개발. 상처 지연된 치유, 주변 혈관, 당뇨병 신 장병에 감소 된 혈은 또한14,,1516을 관찰 했다. 또한, ZDF 쥐 다루기 힘든 피부 궤 양, 당뇨 궤 양 등의 치유 공부에 대 한 적절 한 모델을 수 있습니다.
상처 치유 메커니즘에 인간과 설치류의 차이 피부에 해 부 차이와 연결 됩니다. 정상적인 쥐에서 치유 하는 상처는 다시 epithelialization 및 알갱이 만듦 조직 형성에 따라 인간의 상처 치유 하는 반면 상처 수축, 기반. 일반적으로, 상처 부 설치류 모델에 사용 되 상처 수축 최소화 하는 데 도움이 하 고 비록 nondiabetic 쥐에 상처 수축에 의해 거의 완전히 폐쇄는 알갱이 만듦 조직17, 점차적인 형성에 대 한 수 있습니다. 그러나, 당뇨병 상처 수축 ZDF에서 쥐 장애인, 그리고 상처 치유 주로 발생 통해 다시 epithelialization 및 알갱이 만듦 조직 형성; 따라서,이 과정은 인간의 상처 치유14더 비슷합니다.
Debridement 임상 발생 종종 후 당뇨병 상처를 노출 된 뼈. 12 m m 직경 athymic 누드 마우스18,19 의 뒤에 전체 간격 피부 상처와 정상적인 쥐20의 뒤에 10 m m 직경 전체 간격 피부 상처 이전 연구 조사가 있습니다. 심한 당뇨병 상처에 대 한 임상 모델을 개발, 큰 (15 x 10 m m2) 전체 간격 피부 결함 뼈를 노출 하 고는 하지 않고 만들어졌습니다, 앞에서 설명한21, 제 2 형 당뇨병 및 비만 쥐에서.
일반 루이스 쥐의 ASCs에서 쥐 ASC (rASC) 시트는 ASC 시트 allogenic 이식 통해 창조 되었다. 임상 연습에서 궤 양은 당뇨병 환자 자주 전시 통제 높은 혈액 포도 당 수준 및 높은 몸 질량 색인, 이러한 환자에서 지방이 많은 직물을 얻기의 어려움을 증가 하는 이러한 합병증 원인 상처 치유 장애 등 심각한 당뇨 합병증 때문에 헌 식은 가능 하지입니다. 또한, 당뇨병 전시회와 동물에서 ASCs 속성을 변경 하 고 기능22장애인. 따라서, 여기에 제시 된 프로토콜 정상 쥐에서 rASC 시트 allogenic 이식 및 당뇨병 쥐에 인공 피부의 응용 프로그램 설명 합니다.
이 프로토콜에서 사용 하는 bilayer 인공 피부 상처의 자발적 수축 방지, 새로운 결합 조직 매트릭스의 합성을 촉진과 진정한 피23를 닮았다. 이 프로토콜에서 인공 피부는 rASC 시트에 배치 하 고 상처 수축 또는 느슨한 쥐 피부에서 발생 하는 확대를 방지 하기 위해 나일론 스레드 고정. 또한, 인공 피부 ASC 시트에 대 한 3 차원 프레임 워크를 제공, 이식 ASC 시트 및 상처, 습 한 환경 유지와 감염과 외부 세력 으로부터 상처를 보호 합니다. 마지막으로, 비 접착 드레싱 외부 충격에서 그것을 보호, 촉촉한 상처 환경을 유지 및 흡수 exudate 상처 위에 배치 됩니다.
RASC 시트, 유연한, 얇고 변형 이며 박동 심장24같은 받는 사람 사이트 준수 수 있습니다. 셀-시트 엔지니어링과 다양 한 조직 재건을 위해 사용 되어 치료 효과25,26. 를 생성할 수 있습니다. 임상 치료 잠재력을 전시 하는 ASC 시트의 다양 한 상처 치유 가속 수 있습니다. 또한, ASC 시트, 인공 피부의 사용과 결합의 수용자 이식 다루기 힘든 궤 양이나 화상, 말 초 동맥 질환 또는 교원 질 질병, 관찰 등의 치료에 적용할 수 있습니다 또는 영양 부족은 또는 스테로이드를 사용 하는 환자에 게 관리 될 수 있습니다. 이 방법은 ASCs 이식의 효율성을 증가 시킵니다. 상처 치유에서 쥐 모델 인간의 상처 치유 과정을 닮 고 소형 실험 동물 임상 상태를 모방 하는 심각한 상처 상태를 생성 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
성공적으로 경작 된 rASC 시트에 대 한 가장 중요 한 단계는 다음과 같습니다: 1) 온도 약 37 ° C에서 온도 응답 문화 요리에 경작 하는 동안 유지 되어야 합니다. RASC 시트를 생성 하는 동안 모든 절차 37 ° C 온도-접시에, 수행 하 고 모든 시 약은 저절로 요리31에서 분리에서 세포를 방지 하기 위해 37 ° C로 예 열. 2) 받는 사람에서 쥐 rASC 시트의 성공적인 이식에 대 한 중요 한 비 접착…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 실용적인 조언을 제공 하는 학과의 플라스틱 및 재건 수술, 준 텐도 대학의과 대학, 박사 유키코가 감사 합니다. 우리는 또한 당뇨병 센터의 도쿄 여자의 의학 대학의과 대학 우수 기술 지원의 씨 카 즈 무라를 감사합니다. 이 연구는 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 (MEXT) 일본에서 개발 혁신 시스템 “셀 시트 조직 공학 센터 (CSTEC)” 프로젝트의 학 제 연구 분야 프로그램 고급 혁신 센터의 창조에 의해 지원 되었다.
Materials
| α-MEM glutamax | Invitrogen | 32571-036 | Carlsbad, CA |
| Fetal bovine serum (FBS) | Japan Bioserum Co Ltd. | S1650-500 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Collagenase A | Roche Diagnostics | 10 103 578 001 | Mannheim, Germany |
| 60-cm2 Primaria tissue culture dish | BD Biosciences | 353803 | Franklin Lakes, NJ |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) | Life Technologies | 1490-144 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Life Technologies | 25200-056 | |
| L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate | Wako | 013-19641 | |
| 35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) | CellSeed | NUNC-174904 | Tokyo, Japan |
| Microwarm plate (MP-1000) | Kitazato Science Co., Ltd. | 1111 | |
| Rodent mechanical ventilator | Stoelting | #50206 | Wood Dale, IL |
| 4% isoflurane | Pfizer Japan | 114-13340-3 | Tokyo, Japan |
| Artificial skin (Pelnac®) | Smith & Nephew | PN-R40060 | Tokyo, Japan |
| Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) | Smith & Nephew | 66800679 | Known as Allevyn non-adhessing® in the United State |
| 5-0 nylon suture | Alfresa | EP1105NB45-KF2 | |
| 20 CELLSTAR TUBES | greiner bio-one | 227 261 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430791 | |
| 14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL | Hu-Friedy | P14 | Chicago, IL |
Referências
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