Création et la Transplantation d’une feuille adipeux dérivées de cellules souches (ASC) dans un modèle de cicatrisation diabétique
Summary
Cellules souches dérivées d’adipeux (ASCs) sont facilement isolées et récoltées dans la graisse des rats normaux. Feuilles de NCP peuvent être créés à l’aide de la cellule-fiche technique et peuvent être transplantés dans Zucker rats gras diabétiques présentant pleine épaisseur défauts avec OS exposé de l’épiderme et ensuite recouvert d’une double couche de peau artificielle.
Abstract
La peau artificielle a obtenu des résultats thérapeutiques considérables dans la pratique clinique. Toutefois, les traitements de peau artificielle pour plaies chez les diabétiques avec débit sanguin entravé ou grandes plaies pourraient être prolongées. Thérapies cellulaires sont apparus comme une nouvelle technique pour le traitement des ulcères diabétiques, et ingénierie cellulaire-feuille a amélioré l’efficacité de la transplantation de cellules. Plusieurs rapports ont suggéré que les cellules souches dérivées d’adipeux (ASCs), un type de cellules stromales mésenchymateuses (CSM), présentent un potentiel thérapeutique en raison de leur abondance relative dans les tissus adipeux et leur accessibilité pour la collection par rapport à MSCs provenant d’autres tissus. ASCs semblent donc être une bonne source de cellules souches pour un usage thérapeutique. Dans cette étude, les feuilles de l’ASC de la graisse adipeuse dans l’épididyme de rats normaux de Lewis ont été avec succès créés à l’aide de température Pétri et normal milieu de culture contenant de l’acide ascorbique. Les feuilles de l’ASC ont été transplantés à des rats diabétiques gras (ZDF), Zucker, un modèle de rat de diabète de type 2 et d’obésité, qui présentent une diminution la cicatrisation. Une blessure apparue sur la surface crânienne postérieure, feuilles de l’ASC ont été transplantées dans la plaie et une peau artificielle bicouche a servi à couvrir les feuilles. Rats ZDF qui a reçu les feuilles de l’ASC avaient mieux la guérison des plaies que les rats ZDF sans la transplantation des feuilles de l’ASC. Cette approche a été limitée car les feuilles de l’ASC sont sensibles aux conditions sèches, nécessitant le maintien d’un environnement humide. Par conséquent, la peau artificielle a servi à couvrir la feuille de l’ASC pour éviter le dessèchement. La greffe allogénique de feuilles de l’ASC en combinaison avec la peau artificielle pourrait également s’applique aux autres ulcères insolubles ou des brûlures, tels que ceux observés avec les maladies artérielles périphériques et maladie du collagène et peut être administrée aux patients qui souffrent de malnutrition ou utilisent des stéroïdes. Ainsi, ce traitement pourrait être la première étape visant à améliorer les options thérapeutiques pour diabétique wound healing.
Introduction
La population de patients diabétiques est en augmentation partout dans le monde et a atteint 400 millions en 2015,1; environ 15 à 25 % des patients atteints de diabète sont menacées par la progression d’un ulcère diabétique de bas-extrémité2. Les ulcères diabétiques de bas-extrémité sont insolubles et peuvent nécessiter une période thérapeutique prolongée avec formation de réadaptation après une récupération complète. Une période longue thérapie souvent se traduit par une réduction significative de la qualité de vie des patients. Ainsi, les nouvelles thérapies qui diminuent ou empêchent aggravation doivent être développés pour le traitement des plaies diabétiques. Pour évaluer la guérison des plaies diabétiques, nous avons optimisé un ulcère diabétique cicatrisation modèle chez les rats, qui imite les conditions cliniques pratiques, et évalué si repiquage feuilles adipeux dérivées de cellules souches (ASC) à l’aide de cellules feuilles génie accéléré la guérison des plaies.
Cellules stromales mésenchymateuses (CSM) présentent un excellent potentiel pour accélérer la cicatrisation des plaies en raison de leur capacité d’autorenouvellement, leurs effets immunomodulateurs et leur capacité à se différencier en divers de lignées cellulaires3. CRA est un type de MSC provenant de tissus adipeux, et ils présentent plusieurs avantages sur MSCs dérivés d’autres tissus, y compris leur potentiel angiogénique et paracrine activité4,5. Le tissu adipeux est relativement abondant dans le corps humain, et son accessibilité permet à la collection à l’aide de procédures minimalement invasives. Par conséquent, CRA ont été utilisées expérimentalement pour la cicatrisation des applications,6,,7.
Les rapports précédents ont montré que l’injection directe de suspensions MSC unicellulaires dans les zones autour des blessures peut accélérer la cicatrisation des8,9. Cependant, malgré les rapports de l’accélération de la cicatrisation dans les modèles d’ulcère diabétique après l’injection des suspensions de cellules individuelles, le temps de survie des cellules transplantées à la plaie n’est pas clair.
Dans cette étude, nous avons appliqué des cellules feuilles ingénierie utilisant Pétri de température. Ces plats ont la température polymère de N– isopropylacrylamide covalente sur leur surface10. La couche de polymère greffé permet à adhérence cellule isotherme à ou détachement de la surface de la boîte de Pétri. La surface du plat devient hydrophobe à 37 ° C, permettant aux cellules d’adhérer et se multiplient, tandis que les cellules spontanément se détachent de la surface quand il devient hydrophile à une température inférieure à 32 ° C. Les cellules cultivées peuvent être récoltées comme une feuille de cellules contiguës avec des jonctions cellule-cellule intactes et matrices extracellulaires (ECMs) simplement en réduisant la température ; ainsi, des enzymes protéolytiques qui endommagent l’ECM, tels que la trypsine, ne sont pas requis11. Par conséquent, ingénierie cellulaire-feuille peut préserver les connexions de cellule-cellule et améliorer l’efficacité de la transplantation de cellules.
En outre, transplantation de cellules feuilles augmente les taux de survie des cellules par rapport aux cellules injection12. Dans ce protocole, Zucker les rats diabétiques gras (ZDF) ont été sélectionnés comme un modèle de type 2 diabète et l’obésité avec retard de cicatrisation. Rats ZDF développent spontanément l’obésité à environ 4 semaines. Puis, ils développent le diabète de type 2 avec l’obésité entre 8 et 12 semaines d’âge, à quel point ils présentent l’hyperglycémie associé à l’insulino résistance, la dyslipidémie et hypertriglycéridémie13. Retardé la cicatrisation, diminution du débit sanguin dans les vaisseaux sanguins périphériques et la néphropathie diabétique sont également observées14,15,16. En outre, les rats ZDF pourraient être un modèle approprié pour l’étude de la guérison des ulcères cutanés insolubles, tels que les ulcères diabétiques.
Les différences entre les humains et les rongeurs dans les mécanismes de cicatrisation sont associés à des différences anatomiques de la peau. La cicatrisation chez les rats normaux est basée sur la contraction de la plaie, alors que la cicatrisation des plaies chez l’être humain repose sur la formation réépithélialisation et tissu de granulation. En général, plaie éclisser utilisés dans les modèles de rongeurs contribue à minimiser la contraction de la plaie et permet la formation progressive du tissu de granulation17, bien que les blessures chez les rats non diabétiques sont presque complètement fermés par contraction. Cependant, les diabétiques plaie contraction chez ZDF rats est altérée, et la cicatrisation surtout s’effectue via la réépithélialisation et formation de tissu de granulation ; ainsi, ce processus est plus semblable à l’humaine14de cicatrisation.
Plaies diabétiques avec un OS exposé après débridement sont souvent rencontrés sur le plan clinique. Des études antérieures ont examiné plaies peau pleine épaisseur 12 mm de diamètre sur le dos des athymiques souris Nudes18,19 et blessures de peau pleine épaisseur 10 mm de diamètre sur le dos des souris normales20. Pour développer un modèle clinique de graves plaies diabétiques, plus gros défauts de peau pleine épaisseur (15 x 10 mm2) avec exposés des os et sans le périoste ont été créés, comme décrit précédemment21chez des rats souffrant de diabète de type 2 et de l’obésité.
Feuilles de NCP (SRAC) rat de l’ASCs des rats normaux de Lewis ont été créés par le biais de la greffe allogénique de feuilles de l’ASC. Dans la pratique clinique, autogreffe est irréalisable, parce que les patients diabétiques avec ulcères présentent souvent des complications du diabète sévères, tels que la glycémie élevée incontrôlée et indices de masse corporelle élevé et ces troubles de cicatrisation cause des complications qui augmentent la difficulté d’obtenir des tissus adipeux chez ces patients. En outre, CRA d’animaux avec pièce de diabète modifié les propriétés et troubles de fonction22. Par conséquent, le protocole présenté ici décrit la transplantation allogénique de SRAC feuilles des rats normaux et l’application de la peau artificielle aux rats diabétiques.
La peau artificielle utilisée dans le présent protocole en bicouche empêche la contraction spontanée des blessures, favorise la synthèse d’une nouvelle matrice de tissu conjonctif et ressemble à la vrai derme23. Dans ce protocole, la peau artificielle est placée sur une feuille de la SRAC et fixe avec des fils de nylon pour empêcher la contraction de la plaie ou l’élargissement résultant de peau lâche rat. En outre, la peau artificielle fournit un cadre tridimensionnel pour les feuilles de l’ASC, maintient un milieu humide pour les transplantés feuilles ASC et plaies et protège les plaies de l’infection et de forces extérieures. Enfin, un pansement non adhésif est placé sur la plaie pour le protéger des chocs externes, maintenir un environnement humide et absorber l’exsudat.
Une feuille de la SRAC est mince, souple et déformable et déplacement de sites destinataires, comme un battement cardiaque24peut être respectée. Ingénierie cellulaire-feuille a été utilisée pour la reconstruction de divers tissus et peut générer des effets curatifs25,26. Feuilles de NCP qui présentent un potentiel thérapeutique clinique peuvent accélérer la guérison de nombreux types de plaies. Par ailleurs, la transplantation allogénique de feuilles de l’ASC, combinée à l’utilisation de la peau artificielle, pourrait être applicable au traitement des ulcères insolubles ou des brûlures, tels que ceux observés dans la maladie artérielle périphérique ou maladie du collagène, ou ils peuvent être administrés aux patients qui souffrent de malnutrition ou utilisent des stéroïdes. Cette approche augmente l’efficacité de la transplantation ASCs. Le modèle de rat ZDF cicatrisation produit un état de grave blessure qui ressemble la processus de cicatrisation humaine et imite les conditions cliniques chez un animal expérimental de petite taille.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes plus critiques pour cultiver avec succès une feuille SRAC sont comme suit : 1) la température doit être maintenue à environ 37 ° C au cours de la mise en culture sur les plats de la température de la culture. Lors de la création d’une feuille de la SRAC, chaque procédure a été effectuée sur un thermo-plaque de 37 ° C, et chaque réactif a été chauffé à 37 ° C pour empêcher les cellules de détacher spontanément le plat31. 2) les rats ZDF bénéficiaires doivent ê…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Dr Yukiko Koga du Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Juntendo University School of Medicine, de donner des conseils pratiques. Nous remercions également M. Hidekazu Murata du centre de Tokyo les femmes diabétiques de Medical University School of Medicine excellent soutien technique. Cette étude a été financée par la création de centres d’Innovation pour l’avancée de programme de zones de recherche interdisciplinaire du projet pour les systèmes d’Innovation en développement « cellule feuille Tissue Engineering Center (CCCES) » du ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie (MEXT) du Japon.
Materials
| α-MEM glutamax | Invitrogen | 32571-036 | Carlsbad, CA |
| Fetal bovine serum (FBS) | Japan Bioserum Co Ltd. | S1650-500 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Collagenase A | Roche Diagnostics | 10 103 578 001 | Mannheim, Germany |
| 60-cm2 Primaria tissue culture dish | BD Biosciences | 353803 | Franklin Lakes, NJ |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) | Life Technologies | 1490-144 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Life Technologies | 25200-056 | |
| L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate | Wako | 013-19641 | |
| 35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) | CellSeed | NUNC-174904 | Tokyo, Japan |
| Microwarm plate (MP-1000) | Kitazato Science Co., Ltd. | 1111 | |
| Rodent mechanical ventilator | Stoelting | #50206 | Wood Dale, IL |
| 4% isoflurane | Pfizer Japan | 114-13340-3 | Tokyo, Japan |
| Artificial skin (Pelnac®) | Smith & Nephew | PN-R40060 | Tokyo, Japan |
| Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) | Smith & Nephew | 66800679 | Known as Allevyn non-adhessing® in the United State |
| 5-0 nylon suture | Alfresa | EP1105NB45-KF2 | |
| 20 CELLSTAR TUBES | greiner bio-one | 227 261 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430791 | |
| 14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL | Hu-Friedy | P14 | Chicago, IL |
Referências
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