Oluşturma ve diyabetik yara iyileşmesi manken bir yağ elde edilen kök hücre (ASC) Sheet nakli
Summary
Yağ kaynaklı kök hücreler (ASCs) kolayca izole ve normal sıçanlar FAT’tan hasat. ASC yaprak hücre sayfalık mühendislik kullanılarak oluşturulabilir ve tam-kalınlık sergilenmesi diyabetik yağlı sıçanlar kusurları maruz kemik ile deri ve suni deri bilayer ile kaplı Zucker içine nakledilmektedir.
Abstract
Yapay cilt klinik pratikte önemli tedavi edici sonuçlar elde etti. Ancak, Yapay cilt tedavileri engellemiştir kan akımı veya büyük yaralar ile diyabetik hastalarda yaralar için uzun süreli. Hücre tabanlı terapiler diyabetik ülser tedavisi için yeni bir teknik olarak yer aldı ve hücre sayfalık mühendislik hücre transplantasyonu etkinliğini geliştirdi. Raporlar bir dizi yağ kaynaklı kök hücreler (ASCs), bir tür Mezenkimal stromal hücre (MSC), yağ dokusu ve onların erişilebilirlik için MSCs diğer dokulardan karşılaştırıldığında koleksiyonu için göreli onların bereket nedeniyle tedavi potansiyel sergi tavsiye ettiler. Bu nedenle, ASCs kök hücre terapötik kullanım için iyi bir kaynak gibi görünüyor. Bu çalışmada, ASC sayfaları normal Lewis sıçan epididimal yağ yağ sıcaklık duyarlı kültür yemekleri ve normal kültür askorbik asit içeren orta kullanarak başarıyla oluşturuldu. ASC sayfaları Zucker diyabetik yağ (ZDF) fareler nakledilen, yaranın normal tip 2 diyabet ve obezite, azalmış sorun oluşturan bir fare modeli. Bir yara arka kafatası yüzeyinde oluşturuldu, ASC sayfaları yara içine nakledilen ve bilayer Yapay deri çarşafları kapsayacak şekilde kullanıldı. ASC sayfaları alınan ZDF fareler daha iyi ZDF fareler ASC sayfaları nakli olmadan daha yaranın. ASC sayfası nemli yara çevre bakım gerektiren kuru şartlarda için duyarlı olduğundan bu yaklaşım sınırlıydı. Bu nedenle, Yapay cilt kurutma önlemek için ASC sayfası kapsayacak şekilde kullanıldı. ASC sayfaları Yapay deri ile birlikte allojenik nakli de diğer zorlu ülser veya burns, bu kollajen hastalığı, periferik arter hastalığı ile gözlenen gibi geçerli olabilir ve Beslenme yetersizliği veya steroid kullanan hastalar için yönetilen. Böylece, bu tedavi diyabetik yara iyileşmesi için tedavi olanakları geliştirmeye yönelik ilk adım olabilir.
Introduction
Diyabetik hastalar nüfusu dünya çapında artan ve 20151400 milyon ulaştı; Diyabetli hastaların yaklaşık 15-%25 etkilenir alt ekstremite diyabetik ülser2ilerleme. Alt ekstremite diyabetik ülser zorlu ve uzun süreli tedavi nokta ile rehabilitasyon eğitim tam kurtarma sonra gereksinim duyabilir. Uzun tedavi süresi genellikle hastanın yaşam kalitesini önemli bir azalma olur. Böylece, yeni tedaviler tırmandığı önlemek veya azaltmak diyabetik yaralar tedavisi için geliştirilmelidir. Diyabetik yara iyileşmesi değerlendirmek için biz pratik klinik koşulları taklit eder, bir diyabetik ülser yara iyileşmesi modeli içinde rats, en iyi duruma getirilmiş ve değerlendirilmiş olup yağ kaynaklı kök hücre (ASC) yaprak hücre sayfalık mühendislik kullanarak dikim hızlandırılmış yaranın normal iyileşmesi.
Mezenkimal stromal hücre (MSCs) kendi kendini yenileme kapasitesi, immunomodulatory etkileri ve yeteneklerini çeşitli hücre soy3içine ayırmak için nedeniyle yara iyileşmesi hızlandırılması için mükemmel bir potansiyel sergi. ASCs MSC Yağ dokusundan elde edilen bir türüdür ve onların anjiogenik potansiyel ve parakrin etkinlik4,5de dahil olmak üzere diğer dokulardan türetilmiş MSCs çeşitli avantajlar sergilemek. Yağ dokusu insan vücudunda nispeten bol ve minimal invaziv yordamları kullanarak koleksiyonu için erişilebilirlik sağlar. Bu nedenle, ASCs deneysel olarak yara iyileşmesi uygulamaları6,7için kullanılmaktadır.
Önceki raporları tek hücreli MSC süspansiyonlar direkt enjeksiyon yara çevresinde alanlara8,9şifa yara hızlandırabilir göstermiştir. Ancak, tek hücreli süspansiyonlar enjeksiyon takip diyabetik ülser modellerinde yara iyileşmesi ivme raporları rağmen yara yerinde transplante hücre sağkalım süresi net değildir.
Bu çalışmada, biz sıcaklık duyarlı kültür yemekleri kullanarak hücre sayfalık mühendislik uygulanır. Bu yemekleri onların yüzey10kovalent bağlı sıcaklık duyarlı polimer N– isopropylacrylamide var. Aşılı polimer tabaka ısı kontrollü hücre adezyon veya kültür çanak yüzeyinden dekolmanı için izin verir. Çanak yüzeyi 32 ° c altındaki sıcaklıklarda Hidrofil hale geldiğinde hücreleri kendiliğinden yüzeyinden ayırmak ise uygun ve çoğalırlar, hücrelere izin 37 ° C’de hidrofobik hale gelir Kültürlü hücreler bitişik hücre sabıkası olduğu gibi hücre hücre kavşaklar ve ekstraselüler matrisler (ECMs) olarak sadece sıcaklık azaltarak hasat edilebilir; Böylece, ECM, tripsin gibi zarar proteolitik enzimler gerekli11değildir. Bu nedenle, hücre sayfalık mühendislik hücre hücre bağlantıları korumak ve hücre transplantasyonu etkinliğini artırmak.
Ayrıca, hücre-saç ekimi ne zaman hücre enjeksiyon12‘ ye göre hücre sağkalım oranları artar. Bu protokol için Zucker diyabetik yağlı (ZDF) fareler gecikmiş yara iyileşmesi ile tip 2 diyabet ve obezite model olarak seçildi. ZDF fareler kendiliğinden yaklaşık 4 hafta obezite geliştirmek. Daha sonra 8 ile 12 hafta-in yaş, bu noktada onlar insülin direnci, dislipidemi ve hipertriglisemik13ile ilişkili hiperglisemi sergi arasında obezite ile tip 2 diyabet geliştirmek. Gecikmiş yara periferik kan damarları ve diyabetik nefropati azaltılmış kan akımını şifa, ayrıca14,15,16görülmektedir. Ayrıca, ZDF fareler zorlu Kutanöz ülser, diyabetik ülser gibi şifa eğitim için uygun bir model olabilir.
Yara iyileşmesi mekanizmaları kemirgenler ve insanlar arasındaki farklılıkları deride anatomik farklılıklar ile ilişkilidir. İse insanlarda yara iyileşmesi yeniden epithelialization ve granülasyon dokusu oluşumu üzerinde de, normal fareler şifa yara yara kasılması, temel alır. Genellikle, kemirgen modellerinde kullanılan yara splint yara daralma en aza indirmek için yardımcı olur ve yaralar diyabetik Sıçanlarda neredeyse tamamen daralma tarafından kapatılır, ancak granülasyon dokusu17, kademeli oluşumu için sağlar. Ancak, daralma diyabetik yara ZDF içinde fareler Engelli ve öncelikle şifa yara oluşur yeniden epithelialization ve granülasyon dokusu oluşumu; Bu nedenle, bu işlem daha14şifa insan yara benzerdir.
Debridman sık karşılaşılan sonra klinik olarak maruz kalan kemik ile diyabetik yaralar. Önceki çalışmalarda 12 mm çap tam kalınlıkta deri yaraları korele çıplak fareler18,19 sırtında ve 10 mm çap tam kalınlıkta deri yaraları normal farelere20sırtında inceledik. Şiddetli diyabetik yaralar için klinik bir model geliştirmek için daha büyük (15 x 10 mm2) tam kalınlıkta deri kusurları ile kemik maruz ve kapaklarini olarak yukarıda açıklanan21, tip 2 diyabet ve obezite ile Sıçanlarda oluşturulan.
Sıçan ASC (rASC) normal Lewis sıçan ASCs sayfalarından ASC sayfaları allojenik nakli oluşturulmuştur. Diyabetik hastalarda ülser kez kontrolsüz yüksek kan şekeri ve yüksek vücut kitle endeksi ve yağ dokusu bu hastalardan elde etme zorluğu artırmak bu komplikasyonlar neden yara iyileşmesi bozukluklar gibi ağır diyabetik komplikasyonlar sergilemek çünkü klinik uygulamada, Otolog transplantasyon olanaksız. Ayrıca, ASCs diyabet sergi ile hayvanlardan özellikleri değişmiş ve işlev22Engelli. Bu nedenle, normal sıçanlar rASC sayfalarından allojenik nakli ve Yapay cilt uygulamaya diyabetik sıçan burada sunulan protokolünü açıklar.
Bu protokol için kullanılan bilayer Yapay deri yaraları spontan daralma engeller, yeni bir bağ dokusu matris sentezini teşvik ve gerçek DermIS23benzer. Bu protokol için yapay deri bir rASC sayfaya yerleştirilen ve yara daralma veya gevşek sıçan derisinden kaynaklanan genişleme önlemek için naylon konu ile sabit. Buna ek olarak, suni deri için ASC yaprak üç boyutlu bir çerçeve sağlar, transplante ASC sayfaları ve yaralar için nemli bir ortamın yaratıldığı ve yaralar enfeksiyon ve dış güçler korur. Son olarak, yapışkan olmayan soyunma dış etki korumak, nemli yara ortamı korumak ve çıktı absorbe yara yerleştirilir.
Bir rASC sac ince, esnek ve deforme ve dayak kalp24gibi alıcı siteler hareket için yapıştırılır. Hücre sayfalık mühendislik çeşitli dokuların yeniden inşası için kullanılan ve iyileştirici etkileri25,26. -ebilmek oluşturmak Klinik tedavi potansiyel sergi ASC sayfaları yaralar birçok türleri konusunda bilgi sahibi şifa hızlandırmak. Ayrıca, allojeneik nakli ASC yaprak, suni deri, kullanımı ile kombine tedaviye dirençli ülser veya burns, bu periferik arter hastalığı veya kollajen hastalığı, gözlenen gibi geçerli olabilir veya Beslenme yetersizliği veya steroid kullanan hastalar için yönetilen. Bu yaklaşım ASCs nakli verimliliğini artırır. Yara iyileşmesi ZDF fare modeli işlem şifa insan yara benzer ve küçük ölçekli deneysel hayvan klinik koşullarda taklit eden bir ağır yara koşul üretir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir rASC sayfası başarıyla kültür için en kritik adımlar şunlardır: 1) sıcaklık sıcaklık duyarlı kültür yemekleri kültür sırasında yaklaşık olarak 37 ° C’de saklanması gerekir. Bir rASC sayfası oluşturma sırasında her yordam 37 ° C termo-plaka üzerinde gerçekleştirilmiş ve her reaktif kendiliğinden çanak31ayırma hücreleri önlemek için 37 ° c ısıttı. 2) alıcı ZDF fareler rASC sayfaları başarılı ekimi için kritik olmayan yapışkan soyunma kaldırıl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Dr Yukiko Koga bölümü plastik ve Rekonstrüktif cerrahi, Juntendo Üniversitesi Tıp Fakültesi, pratik tavsiyeler için teşekkür ederiz. Biz de Bay Hidekazu Murata diyabetik Merkezi, Tokyo kadın Tıp Üniversitesi Tıp Fakültesi mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Bu çalışmada oluşturma yenilik merkezleri tarafından gelişmekte olan yenilik sistemleri “hücre sayfası doku Mühendisliği Merkezi (CSTEC)” için projenin disiplinler arası araştırma alanları programı gelişmiş için Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve Teknoloji (MEXT) Japonya’nın desteklenmiştir.
Materials
| α-MEM glutamax | Invitrogen | 32571-036 | Carlsbad, CA |
| Fetal bovine serum (FBS) | Japan Bioserum Co Ltd. | S1650-500 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Collagenase A | Roche Diagnostics | 10 103 578 001 | Mannheim, Germany |
| 60-cm2 Primaria tissue culture dish | BD Biosciences | 353803 | Franklin Lakes, NJ |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) | Life Technologies | 1490-144 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Life Technologies | 25200-056 | |
| L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate | Wako | 013-19641 | |
| 35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) | CellSeed | NUNC-174904 | Tokyo, Japan |
| Microwarm plate (MP-1000) | Kitazato Science Co., Ltd. | 1111 | |
| Rodent mechanical ventilator | Stoelting | #50206 | Wood Dale, IL |
| 4% isoflurane | Pfizer Japan | 114-13340-3 | Tokyo, Japan |
| Artificial skin (Pelnac®) | Smith & Nephew | PN-R40060 | Tokyo, Japan |
| Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) | Smith & Nephew | 66800679 | Known as Allevyn non-adhessing® in the United State |
| 5-0 nylon suture | Alfresa | EP1105NB45-KF2 | |
| 20 CELLSTAR TUBES | greiner bio-one | 227 261 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430791 | |
| 14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL | Hu-Friedy | P14 | Chicago, IL |
Referências
- Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. The global burden of diabetic foot disease. Lancet. 366 (9498), 1719-1724 (2005).
- Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Casteilla, L., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Cousin, B. Adipose-derived stromal cells: Their identity and uses in clinical trials, an update. World J Stem Cells. 3 (4), 25-33 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Zuk, P. . The ASC: Critical Participants in Paracrine-Mediated Tissue Health and Function. , (2013).
- Nie, C., et al. Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis. Cell Transplant. 20 (2), 205-216 (2011).
- Shin, L., Peterson, D. A. Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 33-42 (2013).
- Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res. 27 (10), 1243-1251 (1993).
- Yamato, M., et al. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. Tissue Eng. 7 (4), 473-480 (2001).
- Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Kuhlmann, J., et al. Intramyocellular lipid and insulin resistance: a longitudinal in vivo 1H-spectroscopic study in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 52 (1), 138-144 (2003).
- Slavkovsky, R., et al. Zucker diabetic fatty rat: a new model of impaired cutaneous wound repair with type II diabetes mellitus and obesity. Wound Repair Regen. 19 (4), 515-525 (2011).
- Oltman, C. L., et al. Progression of vascular and neural dysfunction in sciatic nerves of Zucker diabetic fatty and Zucker rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (1), E113-E122 (2005).
- Coppey, L. J., Gellett, J. S., Davidson, E. P., Dunlap, J. A., Yorek, M. A. Changes in endoneurial blood flow, motor nerve conduction velocity and vascular relaxation of epineurial arterioles of the sciatic nerve in ZDF-obese diabetic rats. Diabetes Metab Res Rev. 18 (1), 49-56 (2002).
- Galiano, R. D., Michaels, V., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 12 (4), 485-492 (2004).
- Lin, Y. C., et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model. Acta Biomater. 9 (2), 5243-5250 (2013).
- McLaughlin, M. M., Marra, K. G. The use of adipose-derived stem cells as sheets for wound healing. Organogenesis. 9 (2), 79-81 (2013).
- Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
- Koga, Y., et al. Recovery course of full-thickness skin defects with exposed bone: an evaluation by a quantitative examination of new blood vessels. J Surg Res. 137 (1), 30-37 (2007).
- Cianfarani, F., et al. Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing. Wound Repair Regen. 21 (4), 545-553 (2013).
- Matsuda, K., Suzuki, S., Isshiki, N., Ikada, Y. Re-freeze dried bilayer artificial skin. Biomaterials. 14 (13), 1030-1035 (1993).
- Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
- Iwata, T., et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
- Watanabe, N., et al. Genetically modified adipose tissue-derived stem/stromal cells, using simian immunodeficiency virus-based lentiviral vectors, in the treatment of hemophilia. B. Hum Gene Ther. 24 (3), 283-294 (2013).
- Kim, W. S., et al. Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts. J Dermatol Sci. 48 (1), 15-24 (2007).
- Nakagami, H., et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (12), 2542-2547 (2005).
- Asahara, T., et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 18 (14), 3964-3972 (1999).
- Kato, Y., et al. Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity. Diabetes. , db141133 (2015).
