Automated acústico de distribuição para a diluição de série do Peptide agonistas em potência Determinação Ensaios

Summary

A adsorção de peptídeos em plásticos durante diluições seriais tradicionais baseadas em ponteiras pode afetar significativamente a determinação da potência e confundir a compreensão das relações estrutura-atividade usadas para identificação de chumbo e fases de otimização de chumbo da descoberta de medicamentos. Aqui são descritos métodos para diluição serial acústica automatizada sem contato de amostras de peptídeos.

Abstract

Tal como acontece com a descoberta de drogas de molécula pequena, o rastreio de agonistas peptídicos requer a diluição em série de péptidos para a produção de curvas de concentração-resposta. Rastreio péptidos proporciona um nível adicional de complexidade como métodos de manuseamento de amostras ponta baseada convencionais expor péptidos a uma grande área de superfície de utensílios de plástico, proporcionando uma maior oportunidade para a perda de péptido através de adsorção. Evitar a exposição excessiva aos utensílios de plástico reduz a perda de péptido através de aderência a plásticos e, portanto, minimiza a imprecisões na previsão de potência, e que descrevemos anteriormente os benefícios de acústica não-contacto para distribuir in vitro de rastreio de alto rendimento de agonistas peptídicos ^1. Aqui nós discutimos uma solução de automação totalmente integrado para a preparação de não-contacto acústico de diluições em série de péptidos em placas de microtitulação, utilizando o exemplo de rastreio de péptidos agonistas no receptor de peptídeo-1 semelhante ao glucagon de ratinho (GLP-1R). Nossos métodos permitem em altaOs ensaios para o rastreio de agonistas -throughput célula com base e são facilmente escalável para suportar aumento de produção da amostra, ou para permitir o aumento do número de cópias da placa de ensaio (por exemplo, por um painel de mais linhas de células-alvo).

Introduction

O GLP-1R é um alvo de droga estabelecida no tratamento de diabetes tipo ² 2. O agonista do péptido nativo para este receptor, o GLP-1, tem uma semi-vida in vivo de 2-3 min ^3. A ligação do GLP-1 aos seus receptores alvo resultados acoplados a proteína G na produção a jusante do segundo mensageiro cAMP através do acoplamento à proteína G nativa para a activação da adenilil-ciclase. A medição do AMPc acumulado proporciona um ensaio robusto para monitorizar a activação do receptor e para o rastreio de activos análogos de GLP-1 com propriedades físico-químicas preferidas. Um tal ensaio requer a diluição em série de amostras de ensaio para a ....

Protocol

1. Peptide Diluição Serial

1. Preparar tampão de ensaio: Hanks tamponado com solução de sal (HBSS), suplementado com HEPES 25 mM, 0,1% de BSA e 3 mM-isobutil-1-metilxantina 0,5 (IBMX), pH 7,4.
2. Usar um distribuidor de reagente de grandes quantidades para adicionar sistematicamente 5 uL de tampão de ensaio a cada poço de cinco placas de 384 poços de baixo volume de ensaio de.
   1. Use software interno para criar um programa de distribuição de 5 ul volume de adição a cada poço de uma placa de 384 poços de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Mergulhe distribuição tubagem de caixa em tampão de ensaio e fluida prime.
   3. Coloque 38....

Results

Rotineiramente usar um método de duas etapas para diluir péptidos por via de transferência acústica. Para a primeira etapa, um distribuidor acústico alinhada com a automação é usado para criar quatro peptídicos intermediários da diluições através de duas placas de código (Figura 1a, b). Para o segundo passo, utiliza-se um distribuidor acústico para diluir ainda mais diluições imagens de placas de origem A e B para criar um intervalo de concentração de 11.......

Discussion

Este protocolo descreve a aplicação bem sucedida de distribuição automatizada acústico para diluir em série amostras de péptido ao longo de um intervalo de concentrações de 3 x 10 ⁶ necessitando de menos de 1 ml de amostra. A principal vantagem deste método é o de aumentar a qualidade dos dados através de minimizar a adsorção de péptidos para utensílios de plástico através da exposição reduzida das amostras experimentais para recipientes e utensílios de plástico (tais como pontas de pipeta) que são normalment.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks ' Solução salina balanceada	Sigma-Aldrich	H8264
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A9418
3-isobutil-1-metilxantina	Sigma-Aldrich	I7018	Preparado como um estoque de 0,5 M em
DMSO GLP-1 (7-36) amida	Bachem	H-6795	Preparado como um estoque de 1 mg/ml em PBS, referido como 'controle de referência 100x'Peptídeos
de teste	Produzido internamente na MedImmune		Fornecido em várias concentrações em DMSO ou PBS, conforme apropriado
estoque de peptídeos 100x	Produzido internamente na MedImmune		Teste peptídeo diluído em tampão de ensaio para 100x a concentração final necessária
Solução de azul de tripano, 0,4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Analisador de células Cedex XS	Placas de 384 poços Innovatis
Corning, baixo volume	Sigma-Aldrich	4514
Echo	Labcyte Inc.	P-05525
Reservatório Qualificado Echo	Labcyte Inc.	ER-0055
Echo 550 Manipulador de Líquidos	Labcyte Inc.		Volumes de transferência de gotículas em incrementos de 2,5 nl
Echo 525 Manipulador de Líquidos	Labcyte Inc.		Volumes de transferência de gotículas em incrementos de 25 nl
ACell Benchtop Automation	HighRes Biosolutions	MC522
Cellario Lab Automation Software de agendamento para Life Science Robotics	HighRes Biosolutions
MultidropCombi Reagent Dispenser	ThermFisher Scientific	5840300	Referido como 'dispensador de reagente a granel'HTRF
cAMP Dynamic 2 kit	Cisbio Bioassays	62AM4PEJ
EnVision Multilabel Reader	PerkinElmer