Антитело Этикетировочное с флуоресцентными красителями с использованием магнитных Protein A и G белка бусин
Summary
Метод по-бусинки для мечения антител с небольшими молекулами позволяет маркировать небольшого количества антител непосредственно из клеточных сред. Этот метод совместим с амином и химии тиольной, и может обрабатывать несколько образцов параллельно, вручную или с помощью автоматизированных платформ.
Abstract
Антитела, меченные малыми молекулами, такими как флуоресцентные красители, цитотоксическими лекарственными средствами, а также радиоактивных индикаторов являются важными инструментами в области биомедицинских исследований, иммунодиагностики и совсем недавно в качестве терапевтических средств. Традиционные методы маркировки антител с малыми молекулами требуют очищенных антител при относительно высокой концентрации, включают много стадий диализ и имеют ограниченную пропускную способность. Тем не менее, несколько приложений, в том числе области антитела Drug конъюгатов (АЦП), выиграют от новых методов, которые позволят мечение антител непосредственно из клеточных сред. Такие способы могут позволить антитела к быть подвергнуты скринингу в биологически соответствующих анализов, например, рецептор-опосредованной интернализации антитела анализа в случае с АЦП. Здесь мы опишем метод (по-бусинки) метод, который позволяет маркировать небольших количеств антител непосредственно из клеточных сред. Этот подход использует большой емкости магнитного белка А и белком G. сродства бусинки для захвата антителиз клеточных сред с последующей маркировки с малыми молекулами с использованием либо амин или тиол химию и последующее элюирование меченых антител. Принимая флуоресцентные красители в качестве суррогата для малых молекул, мы демонстрируем маркировку на-бусинки трех различных мышиных антител непосредственно из клеточных сред с использованием как амин и тиольную химию маркировки. Высокая аффинность связывания антител к белку А и белка G обеспечивает высокое извлечение, а также высокую степень чистоты меченых антител. Кроме того, использование магнитных гранул позволяет использовать несколько образцов, которые будут обрабатываться вручную, тем самым значительно улучшая мечения пропускную способность.
Introduction
Антитела , меченные небольшими молекулами являются , пожалуй, наиболее часто используемые реагенты в биологии 1,2. Антитела , меченные флуоресцентными красителями и биотин широко используются в визуализации, иммунологического анализа, проточной цитометрии, вестерн – блоттинга и иммунопреципитации среди других приложений 3-6. Радиоактивно меченных 3,7 находят широкое применение в визуализации и терапии, антител , меченных цитостатическими препаратами (АСДУ) предлагают новые возможности для лечения рака, и два АЦП уже одобрены для терапевтического применения 8. Несмотря на широкое применение, методы для мечения антител остаются на удивление неизменными и обычно включают в себя несколько реакций и обессоливания шаги 9-12. Методы решения работают очень хорошо в тех случаях, когда требуется помечать лишь несколько антител и доступны в высокоочищенной форме при высокой концентрации и в достаточных объемах. Тем не менее, для новых приложений, таких как АЦП, естьнеобходимо маркировать антитела на ранней стадии гибридом , так что они могут быть подвергнуты скринингу на биологически активные свойства, например, рецептор-опосредованный антителами интернализации 13-16. На этапе гибридом, выборочные объемы ограничены, антитела экспрессируются в низких концентрациях, а также ряд образцов велики, следовательно, решение, основанное методы маркировки не подходят.
Чтобы упростить и улучшить пропускную способность традиционных методов маркировки антител, несколько альтернативных подходов были предложены 17,18. Один из подходов состоит в использовании немагнитного белок сродства бусинки, упакованных в маленькие колонки для захвата антител с последующей реакцией с ярлыком и элюции меченого и очищенного белка. Этот метод может быть использован для обозначения антител непосредственно из клеточных сред, тем не менее, использование колонн может быть трудоемким. Метод , основанный магнитный шарик недавно сообщалось , что 19 исключает использование колонн и повышает пропускную способность, но из – зав ячейки антитела способность гранул, только нанограмм на низких микрограммных количеств антител, могут быть помечены.
Недавно мы разработали и использовали Высокая емкость магнитного белка А и белка G бусин (> 20 мг человеческого IgG / мл осевшие шарики) для обозначения антитела , присутствующие в клеточной среде с малыми молекулами 20. Высокая емкость гранул позволяет десятков до сотен микрограммов антител помечать удобно и быстрое магнитный отклик гранул упрощает обработку и обработку большого числа образцов параллельно. Использование флуоресцентных красителей в качестве суррогата для малых молекул, мы покажем, что метод совместим с амином и тиоловой химии маркировки и предлагает высокое извлечение меченых и очень чистых антител.
Этот протокол и сопровождающий видео описывают по-бусинки мечение мышиных антител, присутствующих в средах клеток с использованием магнитных белка A и протеин G-бусинки. Протоколразделен на четыре секции: Секция 1 описывает захват антител на шарик из биологических образцов. После захвата, маркировка антител с флуоресцентным красителем с использованием амина или химии с использованием тиоловой химии описана в разделах 2 и 3 секции соответственно. Наконец, в разделе 4 описывается метод для расчета концентрации антител и красителя соотношение антител.
Protocol
Representative Results
Discussion
Цель данного исследования состояла в том, чтобы разработать способ маркировать антитела, присутствующие в средствах массовой информации клеток при низких концентрациях, с различными малыми молекулами. Такой способ позволит большое количество антител, во время ранней стадии обнаруже…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
None.
Materials
| Magne Protein A Beads | Promega Corporation | G8781 | |
| Magne Protein G Beads | Promega Corporation | G7471 | |
| AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester) | Life Technologies | A20001 | |
| AlexaFluor 532-ME (Malemide) | Life Technologies | A10255 | |
| AlexaFluor 647-ME (Maleimide) | Life Technologies | A20347 | |
| Fluorescein-ME (Maleimide) | Life Technologies | F-150 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5332 |
Referências
- Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).
- Silverstein, A. M. Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets. Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).
- Day, J. J., et al. Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).
- Cunningham, R. E. Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry. Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).
- Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).
- Kraeber-Bodere, F., et al. Radioimmunoconjugates for the treatment of cancer. Semin Oncol. 41 (5), 613-622 (2014).
- Leal, M., et al. Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer. Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).
- Drachman, J. G., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , 380-382 (1996).
- Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies. Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).
- Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).
- Isa, M., et al. High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2. ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).
- Liao-Chan, S., et al. Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores. PLoS One. 10 (4), e0124708 (2015).
- Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe. J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).
- Nath, N., et al. Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye. J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).
- Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase. J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).
- Strachan, E., et al. Solid-phase biotinylation of antibodies. J Mol Recognit. 17 (3), 268-276 (2004).
- Dezfouli, M., et al. Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale. Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).
- Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads. J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).
- Lund, L. N., et al. Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry. J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).
- Safarik, I., Safarikova, M. Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides. Biomagn Res Technol. 2 (1), 7 (2004).
- Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer. Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
- Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates. MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).
