リアルタイムでのキトサンフィルム上にペプチドグラフトを監視するためのキャピラリー電気泳動
Summary
Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.
Abstract
自由溶液キャピラリー電気泳動（CE）は、電界の印加を介して溶液中の分析物、一般的に荷電した化合物を分離します。クロマトグラフィーなどの他の分析分離技術と比較すると、CEは、堅牢、安価で効果的に（複雑な自然のマトリックスまたはポリマーサンプルの数のために）何の試料調製を必要としません。分離された化合物について観察されたシグナルは、溶液中のそれらの量に正比例するようにCEは、高速かつリアルタイムで混合物の進化を追跡するために使用され得る（ 例えば 、化学反応速度論）です。
ここでは、CEの効率は、その後の生物医学的用途のためのキトサンフィルム上へのペプチドの共有結合グラフトを監視するために示されています。キトサンの抗菌性および生体適合性特性は、このような細胞増殖基質として生物医学的応用のための魅力的な材料にします。グリシン – 共有結合ペプチドRGDS（アルギニンをグラフト -アスパラギン酸 – セリン）キトサンフィルムの表面には、細胞の付着を改善することを目的とします。歴史的には、クロマトグラフィーおよびアミノ酸分析は、グラフト化されたペプチドの量の直接測定を提供するために使用されてきました。しかし、CEが提供する試料調製の高速分離と不在がまだペプチドグラフト化プロセスのリアルタイム監視を均等に正確なことができます。 （非グラフト化）ペプチドおよび化学的カップリング剤：CEは、反応混合物の異なる成分を分離し、定量することができます。このように、CEの使用は、下流の適用のための改良されたフィルムになります。
キトサンフィルムは、固体NMR（核磁気共鳴）分光法を介して特徴付けました。この技術は、より時間がかかり、リアルタイムで適用することはできないが、ペプチドの直接的な測定値が得られるので、CE技術を検証します。
Introduction
自由溶液キャピラリー電気泳動（CE）は、それらの電荷-摩擦比1.2をベースにしたソリューションにおける化合物を分離する技術です。電荷対サイズ比は、多くの場合、文献に記載されているが、この単純化は、この作品でポリペプチドを含む、高分子電解質には適用されません、また、小有機分子3に適切ではないことが示されました。 CEは、固定相のみのバックグラウンド電解質（通常は緩衝液）を有していないという点で他の分離技術とは異なります。これは、技術は合成ポリマー7の上に、このような植物繊維5、発酵ビール6グラフトなどの複雑なマトリックス4とサンプルの大規模な範囲を分析する能力に堅牢にすることができ、食品サンプル8、及び難溶性のペプチド9面倒な試料調製なしと精製。これは、溶解の問題が複雑な高分子電解質（複数の場合に特に重要ですuchがしたがって、キトサン10とジェランガム11）ととして集約された、または溶液中に沈殿が存在し、正常サンプルろ過せずに分析されています。また、朝食用シリアルのサンプルの粒子を含む試料を注入関与朝食用シリアル中の糖の分析は、水8中に沈殿させました。これはまた、分岐した高分子電解質またはコポリマー12,13の分析にまで及びます。大規模な作業はまた、特にプロテオミクス14のためのタンパク質の分析のためにCE技術の開発、天然または合成ペプチド15およびタンパク質およびペプチド16のマイクロチップ分離のキラル分離を完了しました。分離分析はキャピラリー内で行われるので、わずかな試料の体積及び溶剤は、クロマトグラフィー5,6,17を含む他の分離技術より低いランニングコストを持ってCEを可能に用いられます。 CEによる分離が速いので、monitoを可能にします反応速度のリング。これは、改善された細胞接着18キトサンフィルム上のペプチドのグラフトの場合に実証されました。
キトサンは、キチンのN個の -deacetylation由来の多糖類です。キトサンの生体適合性21、18,20 19生体接着剤および細胞増殖基質としてキトサンフィルムは、様々な生物医学的用途に使用することができます。例えばフィブロネクチン、コラーゲンおよびラミニンなどの特定の細胞外マトリックスタンパク質への細胞接着は、直接に細胞22の生存にリンクされています。特に、異なる細胞型は、多くの場合、生存および適切な機能のために、異なる細胞外マトリックスタンパク質への付着を必要とします。キトサン膜への細胞接着は、フィブロネクチン23のグラフト化によって増強されることが示されました。しかし、このような大規模なタンパク質の調製、精製及びグラフト化が経済的に実行可能ではありません。小ペプチドの交互範囲HAVeは大きな細胞外マトリックスタンパク質の特性を模倣することができることが示され。例えば、フィブロネクチン模倣体などのペプチドRGD（アルギニン-グリシン-アスパラギン酸）およびRGDS（アルギニン-グリシン-アスパラギン酸-セリン）は、細胞接着24を促進し増加させるために使用されてきました。キトサンフィルム上へのRGDSの共有結合グラフトは、 生体内 18 でフィブロネクチンに付着することが知られている細胞のための改良された細胞付着をもたらしました。より大きなタンパク質を代入すると、同じ機能が大幅なコスト削減を提供していより小さいペプチドとフィブロネクチンが好き。
以前に18を発行し 、ここで、キトサンにグラフト化ペプチドを行いました。先に示したように、このアプローチはカップリング剤EDC塩酸（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を使用して簡単かつ効率的なグラフト化を提供し、NHS（Nヒドロキシスクシンイミド）とRGDSのカルボン酸を官能化するために上にグラフトキトサンフィルム。このグラフト化方法の2つの利点が、それはキトサンまたはペプチドの任意の変更を必要としないことであり、将来の細胞培養アプリケーション18,20との互換性を最大にするために、水性媒体中で行われます。カップリング剤とペプチドを充電することができるように、CEは、反応速度論の分析に適した方法です。重要なことに、CEを介して反応速度論の分析は、グラフト反応のリアルタイムモニタリングを可能にし、したがって、最適化及びグラフト化の程度を定量化の両方を可能にします。
それは日常的に必要ではないが、CE分析の結果は、共有結合グラフトを実証するために、固体NMR（核磁気共鳴）分光法25,26を用いたキトサンフィルム上にグラフト化ペプチドの直接測定によってオフラインで検証することができますフィルム18上にペプチドの。しかし、固体NMR分光法と比較して、リアルタイムに分析することによって提供さCEは、リアルタイムでのペプチドの消費量の定量化、したがって反応の動態を評価する能力を可能にします。
上記の方法は簡単であり、グラフトの程度を間接的に定量化キトサンフィルム上にグラフト化ペプチドのリアルタイム分析を可能にします。実証された方法は、長い反応物または分析されるべき製品を充電することができるように、異なる化学反応のリアルタイム定量的評価に拡張することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明されたプロトコルのシンプルさは、広範囲のアプリケーションに、それは理想的に適しています。しかし、特に注意は、以下の重要なステップのに支払われる必要があります。
適切なCE機器の準備
日に毛細管及び機器の正当性を確認する直前に、未知試料の分離（ならびに分離の一連の終了時）に知られている標準を分離す?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MG, MO’C and PC thank the Molecular Medicine Research Group at WSU for Research Seed Funding, as well as Michele Mason (WSU), Richard Wuhrer (Advanced Materials Characterisation Facility, AMCF, WSU) and Hervé Cottet (Montpellier) for discussions.
Materials
| Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
| Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
| Acetic acid – Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
| RGDS | Bachem | H‐1155 | peptide, bought from Auspep Pty Ltd |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
| Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
| Potassium chloride – Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Disodium hydrogen phosphate – Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
| Potassium dihydrogen phosphate – Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
| Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
| Hydrochloric acid – Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
| Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
| Orbital shaker | IKA | KS260 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
| Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
| Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |
Referências
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