Kapillärelektrofores att övervaka peptid ympning på Chitosan filmer i realtid
Summary
Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.
Abstract
Fri-lösning kapillärelektrofores (CE) separerar analyter, vanligen laddade föreningar i lösning genom tillämpning av ett elektriskt fält. Jämfört med andra analytiska separationstekniker, såsom kromatografi, är CE billig, robust och kräver ingen provberedning (för ett antal komplexa naturliga matriser eller polymera prover) på ett effektivt sätt. CE är snabb och kan användas för att följa utvecklingen av blandningar i realtid (t ex kemisk reaktionskinetik), eftersom signalerna som observeras för de separerade föreningarna är direkt proportionella mot mängden av dessa i lösning.
Här, är effektiviteten hos CE visats för att övervaka den kovalenta ympningen av peptider på kitosan-filmer för efterföljande biomedicinska tillämpningar. Kitosan s antimikrobiella och biokompatibla egenskaper gör den till ett attraktivt material för biomedicinska tillämpningar, såsom celltillväxtsubstrat. Kovalent ympning peptid RGDS (arginin – glycin -asparaginsyra – serin) på ytan av kitosan filmer syftar till att förbättra cellvidhäftning. Historiskt, kromatografi och aminosyraanalys har använts för att tillhandahålla en direkt mätning av mängden ympad peptid. Men gör lika exakt men realtidsövervakning av peptiden ympning processen snabb separation och frånvaro av provberedning från CE. CE är i stånd att separera och kvantifiera de olika komponenterna i reaktionsblandningen: (den icke-ympade) peptiden och de kemiska kopplingsmedel. På detta sätt användningen av CE resulterar i förbättrade filmer för tillämpningar nedströms.
Kitosan filmer karaktäriserades genom solid-state NMR (kärnmagnetisk resonans) spektroskopi. Denna teknik är mer tidskrävande och kan inte tillämpas i realtid, men ger en direkt mätning av peptiden och sålunda validerar CE teknik.
Introduction
Fri lösning kapillärelektrofores (CE) är en teknik som separerar föreningar i lösningar baserade på deras laddning till friktionsförhållande 1,2. Charge-till-storleksförhållande nämns ofta i litteraturen, men denna förenkling gäller inte polyelektrolyter, inklusive polypeptider i detta arbete, och också visat sig inte vara lämpligt för små organiska molekyler 3. CE skiljer sig från andra separationstekniker i det att den inte har en stationär fas, endast en bakgrunds elektrolyt (vanligen en buffert). Detta gör det möjligt för tekniken att vara robust i sin förmåga att analysera ett stort antal prover med komplexa matriser 4 såsom växtfibrer 5, jäsning brygger 6 ympning på syntetiska polymerer 7, matprov 8, och knappast lösliga peptider 9 utan tråkiga provberedning och rening. Detta är särskilt betydelsefullt för komplexa polyelektrolyter som har upplösningsfrågor (sUCH som kitosan 10 och gellangummi 11) och föreligger därför som aggregerat eller utfällt i lösning och har framgångsrikt analyseras utan provfiltrering. Vidare analys av socker i frukostflingor involverade injicera prov med partiklar av frukostflingor prover fälldes i vatten 8. Detta omfattar även en analys av grenade polyelektrolyter eller sampolymerer 12,13. Ett omfattande arbete har också genomförts för att utveckla CE tekniker speciellt för analys av proteiner för proteomik 14, kirala separation av naturliga eller syntetiska peptider 15 och mikrochip separationer av proteiner och peptider 16. Eftersom separation och analys sker i en kapillär, är endast små volymer av prov och lösningsmedel användas som medger CE för att ha en lägre löpande kostnad än andra separationstekniker inkluderande kromatografi 5,6,17. Eftersom separationen av CE är snabb, tillåter den monitoring av reaktionskinetik. Detta visades i fallet med ympning av peptider på kitosan filmer för förbättrad celladhesion 18.
Kitosan är en polysackarid härledd från N -deacetylation av kitin. Kitosan filmer kan användas för olika biomedicinska tillämpningar såsom bioadhesiva 19 och celltillväxtsubstrat 18,20, på grund av chitosan s biokompatibilitet 21. Cellbindning till specifika extracellulära matrixproteiner, såsom fibronektin, kollagener och laminin, är direkt kopplat till överlevnad av cellerna 22. Notably, olika celltyper kräver ofta fastsättning på olika extracellulära matrisproteiner för överlevnad och riktig funktion. Cellbindning till kitosan filmer visades förbättras genom ympning av fibronektin 23; dock, är förberedelse, rening och ympning av sådana stora proteiner inte är ekonomiskt lönsamt. Växelvis ett område av små peptider have visats kunna efterlikna egenskaperna för stora extracellulära matrisproteiner. Till exempel, peptider såsom de fibronektin mimetika RGD (arginin – glycin – asparaginsyra) och RGDS (arginin – glycin – asparaginsyra – serin) har använts för att underlätta och öka cellvidhäftning 24. Kovalent ympning av RGDS på kitosan filmer resulterade i förbättrad cell fäste för celler är kända för att binda till fibronektin in vivo 18. Ersätta större proteiner gillar fibronektin med mindre peptider som har samma funktion ger en betydande kostnadsminskning.
Här var peptid ympning till kitosan utförs som tidigare publicerats 18. Såsom tidigare visats, ger detta tillvägagångssätt enkel och effektiv ympning med hjälp av kopplingsmedel EDC-HCl (1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid) och NHS (N-hydroxisuccinimid) att funktionalisera karboxylsyran av RGDS att vara ympas påkitosanfilm. Två fördelar med denna ympning metod är att den inte kräver någon ändring av kitosan eller peptiden, och det genomförs i vattenmedium för att maximera kompatibilitet med framtida cellodlingstillämpningar 18,20. Som kopplingsmedel och peptiden kan laddas, är CE en lämplig metod för analys av reaktionskinetiken. Viktigt är analys av reaktionskinetik via CE möjliggör realtidsövervakning av ympningsreaktionen och möjliggör både optimering och kvantifiera graden av ympning därmed.
Medan det inte rutinmässigt är nödvändigt kan resultaten av CE-analys valideras off-line genom en direkt mätning av peptiden ympning på de chitosaninnehållande filmer med användning av solid-state NMR (kärnmagnetisk resonans) spektroskopi 25,26 för att demonstrera den kovalenta ympningen av peptiden på filmen 18. Men jämfört med solid-state NMR-spektroskopi, realtidsanalys som tillhandahålls avCE möjliggör kvantifiering av peptiden konsumtionen i realtid och därmed förmåga att bedöma kinetiken för reaktionen.
Ovannämnda metod är enkel och möjliggör realtidsanalys av peptid ympning på kitosan filmer med indirekt kvantifiering av omfattningen av ympning. Den visade metoden kan utvidgas till realtid kvantitativ bedömning av olika kemiska reaktioner så länge reaktanterna eller produkterna som skall analyseras kan laddas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enkelheten i protokollet som beskrivs här gör det idealiskt för utbredd tillämpning. Dock måste särskild uppmärksamhet ägnas åt följande viktiga steg.
Korrekt CE instrument beredning
Det är viktigt att separera en känd standard omedelbart före separationen av okända prov (såväl som vid slutet av en serie av separationer) för att kontrollera giltigheten av kapillären och instrumentet på dagen. Denna standard kan vara en oligoacr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MG, MO’C and PC thank the Molecular Medicine Research Group at WSU for Research Seed Funding, as well as Michele Mason (WSU), Richard Wuhrer (Advanced Materials Characterisation Facility, AMCF, WSU) and Hervé Cottet (Montpellier) for discussions.
Materials
| Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
| Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
| Acetic acid – Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
| RGDS | Bachem | H‐1155 | peptide, bought from Auspep Pty Ltd |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
| Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
| Potassium chloride – Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Disodium hydrogen phosphate – Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
| Potassium dihydrogen phosphate – Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
| Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
| Hydrochloric acid – Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
| Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
| Orbital shaker | IKA | KS260 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
| Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
| Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |
Referências
- Muthukumar, M. Theory of electrophoretic mobility of a polyelectrolyte in semidilute solutions of neutral polymers. Electrophoresis. 17, 1167-1172 (1996).
- Barrat, J. L., Joanny, J. F. . in Advances in Chemical Physics, Vol Xciv Vol. 94 Advances in Chemical Physics. , 1-66 (1996).
- Fu, S. L., Lucy, C. A. Prediction of electrophoretic mobilities. 1. Monoamines. Anal. Chem. 70, 173-181 (1998).
- Harvey, D. . Modern Analytical Chemistry. , (2000).
- Oliver, J. D., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust determination of monosaccharides in plant fibers in complex mixtures by capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1291, 179-186 (2013).
- Oliver, J. D., Sutton, A. T., Karu, N., Phillips, M., Markham, J., Peiris, P., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust monitoring of ethanol fermentations by capillary electrophoresis. Biotechnology and Applied Biochemistry. 62, 329-342 (2015).
- Thevarajah, J. J., Sutton, A. T., Maniego, A. R., Whitty, E. G., Harrisson, S., Cottet, H., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantifying the Heterogeneity of Chemical Structures in Complex Charged Polymers through the Dispersity of Their Distributions of Electrophoretic Mobilities or of Compositions. Anal. Chem. 88, 1674-1681 (2016).
- Toutounji, M. R., Van Leeuwen, M. P., Oliver, J. D., Shrestha, A. K., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantification of sugars in breakfast cereals using capillary electrophoresis. Carbohydr. Res. 408, 134-141 (2015).
- Miramon, H., Cavelier, F., Martinez, J., Cottet, H. Highly Resolutive Separations of Hardly Soluble Synthetic Polypeptides by Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 82, 394-399 (2010).
- Mnatsakanyan, M., Thevarajah, J. J., Roi, R. S., Lauto, A., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of chitosan by degree of acetylation using simple free solution capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 405, 6873-6877 (2013).
- Taylor, D. L., Ferris, C. J., Maniego, A. R., Castignolles, P., in het Panhuis, M., Gaborieau, M. Characterization of Gellan Gum by Capillary Electrophoresis. Australian Journal of Chemistry. 65, 1156-1164 (2012).
- Thevarajah, J. J., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation and characterization of synthetic polyelectrolytes and polysaccharides with capillary electrophoresis. Adv. Chem. 2014, 798503 (2014).
- Sutton, A. T., Read, E., Maniego, A. R., Thevarajah, J., Marty, J. -. D., Destarac, M., Gaborieau, M., Castignolles, P. Purity of double hydrophilic block copolymers revealed by capillary electrophoresis in the critical conditions. J. Chromatogr. A. 1372, 187-195 (2014).
- Righetti, P. G., Sebastiano, R., Citterio, A. Capillary electrophoresis and isoelectric focusing in peptide and protein analysis. Proteomics. 13, 325-340 (2013).
- Ali, I., Al-Othman, Z. A., Al-Warthan, A., Asnin, L., Chudinov, A. Advances in chiral separations of small peptides by capillary electrophoresis and chromatography. J. Sep. Sci. 37, 2447-2466 (2014).
- Kasicka, V. Recent developments in capillary and microchip electroseparations of peptides (2011-2013). Electrophoresis. 35, 69-95 (2014).
- Taylor, D. L., Thevarajah, J. J., Narayan, D. K., Murphy, P., Mangala, M. M., Lim, S., Wuhrer, R., Lefay, C., O’Connor, M. D., Gaborieau, M., Castignolles, P. Real-time monitoring of peptide grafting onto chitosan films using capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 407, 2543-2555 (2015).
- Rinaudo, M. Chitin and chitosan: Properties and applications. Prog. Polym. Sci. 31, 603-632 (2006).
- Li, Z., Leung, M., Hopper, R., Ellenbogen, R., Zhang, M. Feeder-free self-renewal of human embryonic stem cells in 3D porous natural polymer scaffolds. Biomaterials. 31, 404-412 (2010).
- Domard, A. A perspective on 30 years research on chitin and chitosan. Carbohydr. Polym. 84, 696-703 (2011).
- Shekaran, A., Garcia, A. J. Nanoscale engineering of extracellular matrix-mimetic bioadhesive surfaces and implants for tissue engineering. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj. 1810, 350-360 (2011).
- Custodio, C. A., Alves, C. M., Reis, R. L., Mano, J. F. Immobilization of fibronectin in chitosan substrates improves cell adhesion and proliferation. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 316-323 (2010).
- Boateng, S. Y., Lateef, S. S., Mosley, W., Hartman, T. J., Hanley, L., Russell, B. RGD and YIGSR synthetic peptides facilitate cellular adhesion identical to that of laminin and fibronectin but alter the physiology of neonatal cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 288, C30-C38 (2005).
- Lefay, C., Guillaneuf, Y., Moreira, G., Thevarajah, J. J., Castignolles, P., Ziarelli, F., Bloch, E., Major, M., Charles, L., Gaborieau, M., Bertin, D., Gigmes, D. Heterogeneous modification of chitosan via nitroxide-mediated polymerization. Polym. Chem. 4, 322-328 (2013).
- Gartner, C., Lopez, B. L., Sierra, L., Graf, R., Spiess, H. W., Gaborieau, M. Interplay between Structure and Dynamics in Chitosan Films Investigated with Solid-State NMR, Dynamic Mechanical Analysis, and X-ray Diffraction. Biomacromolecules. 12, 1380-1386 (2011).
- Castignolles, P., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Sprong, E., Ferguson, C. J., Gilbert, R. G. High resolution separation of oligo(acrylic acid) by capillary zone electrophoresis. Macromol. Rapid Commun. 27, 42-46 (2006).
- Chamieh, J., Martin, M., Cottet, H. Quantitative Analysis in Capillary Electrophoresis: Transformation of Raw Electropherograms into Continuous Distributions. Anal. Chem. 87, 1050-1057 (2015).
- Maniego, A. R., Ang, D., Guillaneuf, Y., Lefay, C., Gigmes, D., Aldrich-Wright, J. R., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of poly(acrylic acid) salts according to topology using capillary electrophoresis in the critical conditions. Anal. Bioanal. Chem. 405, 9009-9020 (2013).
- Chung, T. W., Lu, Y. F., Wang, S. S., Lin, Y. S., Chu, S. H. Growth of human endothelial cells on photochemically grafted Gly-Arg-Gly-Asp (GRGD) chitosans. Biomaterials. 23, 4803-4809 (2002).
