나무 형성 및 보조 스템 개발에 관여하는 유전자 및 발기인 유학을위한 유도 체세포 업종 분석 (ISSA)의 사용
Summary
Here we present a protocol that facilitates the medium to high throughput functional characterization of gene and promoter constructs in tree secondary stem tissue within comparatively short time frames. It is efficient, easy to use and widely applicable to a range of tree species.
Abstract
나무 차 줄기 성장과 관련된 나무 형성은 생물학적 및 상업 관점에서 모두 중요하다. 그러나, 상대적으로 작은 자신의 개발에 적용되는 분자 제어에 대한 알려져있다. 이는 종종 이차 성장 과정의 연구와 관련된 물리적 자원 및 시간 제한 부분이다. 생체 외 다수의 기술 우디 비 목본 식물 종 둘 중 식물의 일부 또는 전부를 식물 시스템을 포함하는 데 사용되어왔다. 그러나, 보조 줄기 성장 과정의 연구에 대한 적용 가능성에 대한 질문은, 특정 종과 노동 강도의 반항은 높은 처리량 응용 프로그램에 대한 매체들은 금지합니다. 차 줄기 개발 및 나무 형성을 볼 때 또한, 조사에서 각 특성은 성장의 몇 년 후 늦게 나무의 라이프 사이클에서 측정 될 수 있습니다. 생체 내 페이지에서 이러한 문제의 대안을 해결에서rotocols 직접 식물의 보조 줄기 형질 전환 체세포 조직 섹터들의 생성을 포함하는 유도 된 체세포 분석 분야라는 개발되었다. 이 프로토콜의 목적은 나무 종의 범위로 사용될 수있다 유전자 프로모터와 기능적 특성화 형질 보조 식물 조직을 생성하는 효율적인 쉽고 비교적 빠른 수단을 제공하는 것이다. 여기에 제시된 결과 보조 보조의 프로모터 발현 패턴뿐만 아니라 수종 그 나무 형태 학적 특성의 다양한 줄기 형질 전환 보조 줄기 섹터 용이 높은 중간을 용이하게 평가할 수있다 줄기 모든 살아있는 조직 및 세포 유형에서 생성 될 수 있음을 보여준다 처리량 기능적 특성.
Introduction
나무는 행성 바이오 매스의 상당한 양을 포함하고, 거대한, 생물, 문화, 상업 중요하다 유래한다. 보조은 많은 다른 생명체에 대한 리소스와 쉼터를 제공함으로써 서식지를 만들 유래한다. 그들은 서식과 목재, 펄프 및 종이 및 기타 목재 및 비 목재 제품의 생산을위한 재생 가능한 자원의 역할 생태계에 많은 다른 서비스를 제공합니다. 보조 줄기 개발 및보다 구체적 우드 형성을 특정 세포 유형의 발달을 조절하는 분자 착물 시스템에 의해 관리되고, 생화학 세포벽의 조성 및 방법은 이들은 조직 및 기관을 형성하기 위해 배열된다. 차 줄기 개발 및 나무 형성의 분자 기초를 해부하는 내부와 줄기 사이에, 긴 세대 시간, 밖으로 교차 결합 시스템, 높은 이형, 높은 유전로드, 계절 휴면 긴 나무 줄기 속성의 변화 등 많은 요인에 의해 혼동된다 성숙한특성 설립 기간과 성숙한 나무의 얇은 실제 크기. 그 결과, 식물 발달의 분자 제어 대부분의 다른 양태의 상세한 지식 보조 줄기 개발 상대적인 이해 아직 초기 단계에있다.
시험관 수많은 기술 연구, 특히 목재와 이차 세포벽 형성 보조 줄기 현상을 이해하는 데 사용되어왔다. 이러한 프로토콜은 형질 전환 식물체 중 생성되는 또는 특정 보조 세포 나 조직은 목재 및 / 또는 보조 줄기 개발 하나의 특정 측면의 연구를 위해 변환되는 전체 식물 또는 식물 파트 시스템의 사용을 포함한다. 형질 전환 식물체는 식물 조직 및 세포 유형의 다양한 포스트 유전자 변형을 복구 할 수 있으나, 진행은 느리다 특히 길기 때문에, 재생에 목섬유 특성을 분석하고 (10 세의 순서) 성숙 배 줄기 때 높은 기술적 노동 demanDS, 낮은 후보 유전자의 처리량뿐만 아니라 일부 우디 식물 종을 전파 어려움. 유사 기술들은 성공적 이러한 한계 중 일부를 극복 애기 비 목질 모델 시스템에서 개발 되었으나, 이들에 존재하지 않는 모든 보조 줄기 세포 유형의 줄기와 계절이나 수명에 관한 특성은 종이 연구 될 수 없다. 대안 적으로, Pinu의 라디 캘러스 배양 3과 식물 일부 시스템은 관련 시간대를 줄일 수 있습니다. 이 방법은 그러나 개별 세포 유형의 연구로 제한하고 시험 관내 실험에 언급 한 바와 같이 유사한 제약 조건을 고통된다. 마찬가지로, 전체 줄기 외식을 포함 혀끝의 줄기 문화 (4)는 약속을 보여 주었다하지만 아직 특정 유전자 또는 관심의 발기인의 연구에 적용되지 않았다. 최근 모상근 배양을 포함한 다른 프로토콜 유칼립투스 개발되었으며 성공적이었다줄기는 단일 수종으로 제한됩니다 날짜보다 5 그러나,이 방법은 여전히 체외 배양이 필요합니다 적용, 오히려 보조 뿌리를 포함한다.
여기에 기술 된 바와 같이 유도 된 체세포 섹터 분석 (ISSA)는, 목재의 형성 및 보조 줄기 조직 개발 의심 역할과 유전자 프로모터 높은 처리량 기능성 스크리닝 도구 매체를 제공하는 이러한 문제를 극복하기 위해 개발되었다. ISSA 노동을 극복하면서 그대로 보조 줄기 형질 전환 세포 및 조직을 생산하기 위해 걸리는 시간을 줄이기 위해 개발 된 생체 전환 및 스크리닝 시스템 일상적 기술적 처리량 제한 관내 방법에 사용되는. 이차 g없이 수종 및 관심 조직에서 단시간 줄기에 기재되어있는 프로토콜에 독립적 변형 티슈 섹터 수백 개의 셀의 동시 생성을 허용비교적 짧은 시간 프레임과 낮은 노동 비용 내에서 enetic 및 / 또는 환경 변화. ISSA 생체 기술은 제 cambial 분화에 관여하는 유전자 및 / 또는 발기인의 연구를 통해 보조 줄기 조직에 정제 된 이후 차 줄기 6 버드 (7) 조직에 대한 설명과이되었다은 다음과 같습니다 튜 불린 (TUB) 8 fasciclin 같은 아라 비노 갈 락탄을 ( FLA) 9, 셀룰로오스 합성 효소 (CESA) (10), 이차 전지 벽 관련 NAC 도메인 (SND2) 11 ARBORKNOX (ARK1) 12 정말 흥미로운 새로운 유전자 (RING) H2 단백질 13. 이차 실시 하였다 이들 연구 포플러 유칼립투스 식물 세포 형태, 셀 벽 화학 유전자 발현에 제공 통계 줄기.
여기에 설명 된 프로토콜은 경험 a를 소집하기위한 것입니다차에 대한 지식이 지난 10 년간 출판 및 출판되지 않은 연구의 범위에서 ISSA의 개발 및 응용 프로그램을 통해 얻었다. 그들은 차 줄기 조직 (6)의 생체 내 변화에 초점을 은백양 'pyramidalis'복제, 유칼립투스뿐만 아니라 11 유칼리 나무 globulus의 X의 camaldulensis 클론을 포함하는 연구에 집중. 이 문서는 식물과 박테리아, 줄기 조직의 성장과 조직의 수확, 형질 전환 세포와 조직의 식별, 수집 및 데이터 분석을위한 표현형 평가 및 방법에 대한 준비 변환의 재배에서 프로토콜을 통해 연구자합니다. 기술이 성공적으로 인해 공간 제한도 9,11를 세포벽 단당류 조성물을 측정하기 위하여 적용되었지만, 본 문서는 보조 일에서의 유전자 발현 패턴을 세포와 조직 형태를 측정하고 이해하기 위해 사용되는 기술에 집중EMS 만. 따라서, 설명 된대로 프로토콜은 높은 처리량 방법에 저렴한 비용, 기술적으로 쉽고, 매체를 이용하여 줄기 차에 연결된 유전자의 역할 및 / 또는 표현에 더 통찰력을 얻기 위해 찾는 사람들에게 적합하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
ISSA 프로토콜은 유전자와 나무에 관련된 관심의 발기인의 분석을 위해 몇 개월의 공간에 나무 종의 형질 전환 줄기 조직의 생성을위한 비교적 간단하고 효율적인 방법이며 형성 줄기. 살아있는 식물을 유지 넘어 약간의 노력은 광범위한 배양이 조직이나 식물, 목재 생산 년까지 걸릴 수 있습니다 시작하거나 어디 진정한를 유지하기 위해 필요한 시험 관내 방법으로 대조를 이룬다 접종 다?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge funding support for aspect of the work through Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) and LP0211919 (GB) and industry partners Sappi and Mondi as well as Australian Postgraduate Award (EM) from the Australian Research Council and the Young Innovators and Scientist Award through the Australian Department of Agriculture (LT). We also like to thank the Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan and Simon Southerton for the many discussions and ideas they put forward during the development of this protocol and to Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel and Noemie Defaix for assistance in laboratory related work.
Materials
| Plants | NA | NA | Please consult local nursery suppliers for plants as needed |
| Agrobacterium strain | NA | NA | There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region. |
| Binary vector (gene and promoter) | NA | NA | We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community. |
| LB media | Sigma | L3022 | The same product could be sourced from another company |
| LB media with agar | Sigma | L2897 | A like product could be sourced from another company |
| Antibiotics | Sigma | NA | The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a range of companies |
| 50 ml Screw top tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | The same product could be sourced from another company |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | The same product could be sourced from another company |
| MS Media | Sigma | M9274 | The same product could be sourced from another company |
| Scalpel blade no 11 | Sigma | S2771 | The same product could be sourced from another company |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | This is the best product to use to bind the cambial window post creation |
| 14 ml round bottom tubes | Thermo Scientific | 150268 | The same product could be sourced from another company |
| EDTA | Sigma | E6758 | The same product could be sourced from another company |
| Triton | Sigma | X100 | The same product could be sourced from another company |
| X-Gluc | X-GLUC direct | You will need to go to the website to order – http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Potassium Ferricyanide (III) | Sigma | 244023 | The same product could be sourced from another company |
| Potassium Ferrocyanide (II) | Sigma | P9387 | The same product could be sourced from another company |
| Litmus paper | Sigma | WHA10360300 | The same product could be sourced from another company |
| Single edge razor blade | ProSciTech | L055 | The same product could be sourced from another company |
| Double edge razor blade | ProSciTech | L056 | The same product could be sourced from another company |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | The same product could be sourced from another company |
| Sample vial with screw cap | ProSciTech | L6204 | The same product could be sourced from another company |
| Ethanol | sigma | E7023 | The same product could be sourced from another company |
| LR white | ProSciTech | C025 | The same product could be sourced from another company |
| Embedding Mould | ProSciTech | RL090 | We recommend this variety, however there are plenty of options available |
| Water Soulable mounting media | ProSciTech | IA019 | One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored. |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | A like product could be sourced from another company |
| Glacial acetic acid | Sigma | A9967 | A like product could be sourced from another company |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | A like product could be sourced from another company |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised | |
| Image J imaging software | can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
Referências
- Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation – benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
- Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
- Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
- Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
- MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
- Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
- Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
- Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
- Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Hawkins, S., Pilate, G., Duverger, E., Boudet, A., Grima-Pettenati, J., Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , 271-295 (2002).
- Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
- Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).
