Adenofection：用于研究分子伴侣在细胞地貌被耗尽，救援实验中的角色方法
Summary
We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.
Abstract
细胞过程，例如有丝分裂和细胞分化是通过细胞形状的变化在很大程度上依赖于细胞骨架结构的适当改造管辖。这涉及到更高阶的大分子结构的在给定时间和地点的组装拆卸，这个过程是引起的蛋白质的过表达干扰特别敏感。方法，可以保留蛋白质稳态和维持近到正常细胞形态是高度理想的是确定感兴趣的蛋白在广泛的细胞过程的功能的贡献。基于RNA干扰瞬态枯竭救援实验是分析蛋白质的功能和结构要求强大的方法。然而，从它的生理水平最小偏差靶蛋白的重新引入是一个真正的挑战。在这里，我们描述了开发研究的分子伴侣的作用的方法称为adenofection的在分裂细胞的正常d动作伙伴和肌动蛋白重塑的关系。 HeLa细胞耗尽BAG3与siRNA双链体靶向3'UTR区。 GFP标记BAG3蛋白同时再引入使用耦合到转染试剂重组腺病毒的细胞的> 75％。启用Adenofection表示在耗尽BAG3在HeLa细胞中接近生理水平BAG3-GFP蛋白，在不存在应激反应。观察内源性热休克蛋白分子伴侣蛋白动态平衡的主要胁迫诱导监管的水平没有影响。此外，通过添加杆状病毒驱动的荧光标记物的表达在细胞转导转染时，我们可以通过时间推移显微解剖的有丝分裂细胞动力学与正常的有丝分裂进展的最小扰动的分析。 Adenofection也适用于难以感染小鼠细胞，并适合于成肌细胞的diff功能分析erentiation成肌管。因此adenofection提供了一个通用的方法来进行参与依赖于高阶骨架动力学敏感的生物过程的蛋白的结构与功能分析。
Introduction
在哺乳动物细胞中基因表达的功能失活的金标准解剖蛋白质的功能。新开发的基础上，利用位点特异性核酸酶如锌指核酸酶的基因组编辑的技术和聚集定期相互间隔短回文重复序列（CRISPR）/ CAS9现在允许的有针对性的基因缺失和突变1,2-细胞系的产生。这些新的方法应该彻底改变我们正在研究蛋白质的功能和我们人类疾病的遗传学的理解方式。在一些情况下，然而，长期或完整基因敲除是不希望的，并可能会引起二次电池的补偿机制。遗传修饰的细胞系的产生，也可与原代细胞培养用有限增殖的能力，或当一大组在各种细胞类型的突变的筛查寻求处理时限制。这经常需要用于确定小区b的依赖性对蛋白质的结构要求iological过程。为此，通过RNA干扰，能够在各种细胞背景短暂枯竭救援实验可逆击倒仍然是一个简单而强大的方式来执行的利率3蛋白的结构与功能分析。但是，这种方法的主要缺点是难以实现高效的沉默和重新引入的在接近生理水平的兴趣或它的变体的蛋白质中的大多数细胞群。这是至关重要的，以使全面研究试图关联在单个细胞（亚效等位基因表型）与那些在小区基于人口的分析可见，例如在蛋白质 – 蛋白质相互作用的水平可见的作用效果。
使用传统的转染方法，人们很难达到一个人口众多的细胞外源性蛋白质的同质和低表达。重组病毒的细胞转导像腺病毒往往使外源蛋白质的更标准化的表达。然而，腺病毒的摄取是由CAR受体，其是在非人类细胞中不存在或仅在某些人类细胞类型弱表达限定。此外，腺病毒的细胞进入激活信令调节细胞形状和粘附4-6通路。研究细胞地貌的调节机制时，这显然是不理想的。当我们进行了伴侣复杂，BAG3-HSPB8的功能分析，在细胞分裂和肌动蛋白，我们正面临着这个问题。开拓性的工作压力7,8期间描述的蛋白质的质量控制和自噬这个伴侣复合作用。大部分这些研究，然而，依赖于蛋白表达，假定分子伴侣被应力过程中通常上调。这已经离开开放是否BAG3的问题，在与HSPB8复杂，可以向表达个分裂的细胞的正常运行ESE伴侣像许多癌细胞类型9。特别是，无论是伴侣复合有助于控制有丝分裂的进展非常感兴趣，因为HSPB伴侣和细胞骨架的动态10之间的连接出现基于肌动蛋白结构的重塑。为了解决这个问题，我们寻求发展为耗尽救援实验一种有效的方法，将不与有丝分裂进展或细胞形态干扰，并且这将保留蛋白质稳态避免大分子复合物的动力学的二次扰动调节细胞形状的改变。因此理想情况下，应同时进行的感兴趣的基因的耗尽加回。
腺病毒的复合物与阳离子聚合物或脂质的使用已被描述为促进在体外和体内 11,12基因转移。例如，磷酸钙（CAPI）出现以形成沉淀腺病毒增强通过CAR-独立通路13病毒绑定条目。事实上，我们发现，基于腺病毒的细胞转导和转染结合的阳离子化合物可增强耗尽救援实验的效率。这允许我们通过3-降低病毒的量至20倍，这取决于从更广泛的窗口的细胞系和感兴趣的基因，并从中受益，以便在大多数附近内源水平来调整外源蛋白的表达的对细胞形态的影响降到最低的兴趣的细胞群。在这种情况下，我们也可以实现内源蛋白质表达（> 75％）的高效率击倒。我们特此通过步骤描述了方法步骤，并提供证据表明，由热休克蛋白家族的应激诱导的分子伴侣的不变的水平所评估蛋白质稳态不显著扰动，使得该方法适于生理RO的功能分析按时间推移视频显微镜分子伴侣乐。该协议是适合于细胞的同步程序，并有丝分裂进展过程中使用可商购的杆状病毒为低水平荧光标记的，与正常的肌动蛋白为基础的和主轴动力学干扰最小的共表达。我们进一步显示的方法中，这是适用于“硬转导”小鼠C2C12细胞，对成肌细胞分化无显著影响到体外肌管的通用性。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们描述的方法使得能够进行耗尽救援实验，这是适用于那些对影响的化学计量和蛋白质复合物和大分子结构的动力学的蛋白质的过表达特别敏感细胞生物学过程的功能分析。有丝分裂的细胞分裂是涉及在细胞中的整体结构的最引人注目的和引人注目的变化微调细胞地貌的一个极端的例子。使用adenofection用市售BacMam试剂相结合，引进低，但检测的量的肌动蛋白和微管蛋白标志物细胞成像?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research (Grant no 7077), and by the Bellini Foundation and Roby Fondazione.
Materials
| C2C12 Mouse Myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| Adenovirus custom design | Welgen | Custom design | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10582 | |
| CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10614 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher | 12483-020 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glass bottom dishes, 35mm | MatTek Corperation | P35G-1.5-20-C Case | |
| HeLa-RFP-H2B | Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada | Klebig C et al. 2009 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| Horse Serum, New Zealand | Thermo Fisher | 16050-122 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher | 13778-150 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha | Wisent | 310-101-CL | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides | Thermo Fisher | 12000-022 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red | Thermo Fisher | 41061-029 | |
| Na2HPO4 | Biobasic | S0404 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher | 11058-021 | |
| rAVCMV-LifeAct-TagGFP2 | IBIDI | 60121 | |
| siRNA duplexes | Dharmacon | Custom design | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Trypsine 2.5% | Thermo Fisher | 15090-046 |
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