Adenofection: Een methode voor het bestuderen van de rol van de Molecular Begeleiders in Cellular Morfodynamica door uitputting-Rescue Experimenten
Summary
We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.
Abstract
Cellulaire processen zoals celdeling en celdifferentiatie worden beheerst door veranderingen in cel vorm die grotendeels afhankelijk zijn van een goede herinrichting van de cel cytoskelet structuren. Het betreft de montage-demontage van hogere orde macromoleculaire structuren op een gegeven tijdstip en locatie, een proces dat bijzonder gevoelig is voor storingen veroorzaakt door overexpressie van eiwitten. Methoden die eiwit homeostase te behouden en te handhaven die vlak bij normale celmorfologie zeer gewenst om de functionele bijdrage van een eiwit van belang in een breed scala van cellulaire processen bepalen. Voorbijgaande depletie-rescue experimenten gebaseerd op RNA interferentie zijn krachtige benaderingen van eiwit functies en structurele vereisten te analyseren. Echter, herinvoering van het doelwit eiwit met minimale afwijking van zijn fysiologische niveau is een echte uitdaging. Hier beschrijven we een werkwijze genoemd adenofection die werd ontwikkeld om de rol van moleculaire chaperonnes een studied partners bij het normale gebruik van delende cellen en de relatie met actine remodeling. HeLa cellen werden ontdaan van bag3 met siRNA duplexen gericht op de regio 3'UTR. GFP-gelabeld eiwitten bag3 gelijktijdig opnieuw in> 75% van de cellen onder toepassing van recombinante adenovirussen gekoppeld transfectie reagentia. Adenofection nodig om bag3-GFP eiwitten op nabij fysiologische niveaus in HeLa-cellen ontdaan van bag3 drukken, in afwezigheid van een stressrespons. Er werd geen effect waargenomen op de niveaus van endogene heat shock eiwitten chaperones, de belangrijkste stress induceerbare regulatoren van eiwit homeostase. Verder kan door toevoeging baculovirussen de expressie van fluorescente merkers bij de cel transductie transfectie konden ontleden mitotische celdynamiek door time-lapse microscopische analyses met minimale verstoring van de normale progressie van de mitose. Adenofection ook voor moeilijk te infecteren muizencellen, en geschikt voor functionele analyse van myoblasten diffdifferentiatie in myotubes. Aldus adenofection een veelzijdige werkwijze te voeren structuur-functie analyse van eiwitten betrokken bij gevoelige biologische processen die berusten op hogere orde cytoskelet dynamiek.
Introduction
Functionele inactivatie van genexpressie in zoogdiercellen is de gouden standaard eiwitfuncties ontleden. Nieuw ontwikkelde technologieën genoom bewerking gebaseerd op het gebruik van plaats-specifieke nucleasen zoals zinkvinger nucleasen en geclusterde regelmatig interspaced korte palindroom repeats (CRISPR) / CAS9 nu toe het maken van cellijnen met gerichte gen-deletie en mutatie 1,2. Deze nieuwe aanpak moet een revolutie op de manier waarop we het bestuderen van de functies van eiwitten en ons begrip van de genetica van ziekten bij de mens. In sommige gevallen echter, langdurige of volledige gen knockout is niet wenselijk en kan secundaire cel compensatiemechanismen veroorzaken. Het genereren van genetisch gemodificeerde cellijnen kunnen ook beperkt bij de behandeling van primaire celculturen met beperkte vermeerderingsvermogen of wanneer screening van een groot aantal mutaties in verschillende celtypen wordt gevraagd. Dit is vaak nodig voor het bepalen van de afhankelijkheid van een cel biological proces op structurele vereisten van een eiwit. Daartoe reversibele knockdown door RNA interferentie die voorbijgaande depletie-rescue experimenten in verschillende cellulaire achtergronden maakt nog steeds een eenvoudige en krachtige aanpak uitvoeren structuur-functie analyse van een eiwit van belang 3. Echter, een belangrijk nadeel van deze aanpak is de moeilijkheid om efficiënt silencing bereiken en het eiwit van belang of varianten op bijna fysiologische niveaus opnieuw in een meerderheid van de celpopulatie. Dit is belangrijk om uitgebreide studies die proberen om functionele effecten waargenomen op het niveau van enkelvoudige cellen (hypomorfe fenotype) met die bij cel-populatie gebaseerde testen, bijvoorbeeld op eiwit-eiwitinteracties correleren schakelen.
Transfectie met behulp van klassieke methoden, kan men nauwelijks bereiken homogeen en lage expressie van exogene eiwitten in een grote populatie van cellen. Transductie van cellen met recombinante virussenzoals adenovirussen maakt vaak meer genormaliseerde expressie van exogene eiwitten. Toch is adenovirus opname beperkt door de CAR receptor, dat afwezig is in niet-humane cellen of slechts zwak tot expressie gebracht in bepaalde humane cellen. Bovendien is de cellulaire binnenkomst van adenovirussen activeert signaalroutes dat regelen cel vorm en adhesie 4-6. Dit is uiteraard niet wenselijk bij het bestuderen van regulerende mechanismen van de cel morfodynamiek. We werden geconfronteerd met dit problematisch wanneer we functionele analyses van een chaperonne complex, bag3-HSPB8 ondernam, in celdeling en actine dynamiek. Pionierswerk had een rol voor deze chaperone complex in proteïne kwaliteitscontrole en autofagie beschreven tijdens stress 7,8. De meeste van deze studies echter gebruikt eiwitoverexpressie, aannemende dat de chaperones normaal opgereguleerd tijdens stress. Dit liet de vraag of bag3 hierbij in complex met HSPB8, kan bijdragen tot de normale werking van delende cellen tot expressie these chaperones zoals vele typen kankercellen 9. In het bijzonder de vraag of de chaperonne complex draagt bij aan de herinrichting van actine gebaseerde structuren die mitotische progressie was van groot belang te controleren, gezien de opkomende verbindingen tussen hspB chaperones en cytoskelet dynamiek 10. Om dit probleem aan te pakken, waren we op zoek naar een efficiënte methode voor het depletie-rescue experimenten die niet zou verstoren mitotische progressie of cellulaire morfologie, en welk eiwit homeostase zou behouden secundaire verstoring van de dynamiek van macromoleculaire complexen te voorkomen dat het reguleren van de cel-vormveranderingen ontwikkelen . Dus idealiter depletie-add-back van het betreffende gen gelijktijdig worden uitgevoerd.
Het gebruik van complexen van adenovirus met een kationisch polymeer of lipiden is beschreven genoverdracht in vitro pt in vivo 11,12 bevorderen. Bijvoorbeeld, calciumfosfaat (CAPI) blijkt een precipitaat vormen metadenovirus dat virus binden-entry via een CAR-onafhankelijke route 13 te verbeteren. Inderdaad, vonden we dat het combineren van adenovirus-gebaseerde cel transductie en transfectie met kationische verbindingen van de efficiëntie van de uitputting-rescue experimenten zou kunnen vergroten. Dit liet ons toe om de hoeveelheid virus te verlagen 3- tot 20-voudige, afhankelijk van de cellijn en het gen van belang, en van de toevoeging venster om de expressie van exogene eiwitten verstellen nabij endogene niveaus in de meerderheid van een cel bevolking van belang met een minimale impact op cellulaire morfologie. Onder dergelijke omstandigheden, kunnen we ook bereiken een hoog rendement knockdown van endogene eiwit expressie (> 75%). We beschrijven hierbij de werkwijze stapsgewijs en bewijzen dat eiwit homeostase niet significant verstoord gemeten met de onveranderde niveaus van stress geïnduceerde chaperones van de hitteshockproteïne familie, waardoor de werkwijze geschikt voor functionele analyse van de fysiologische role van moleculaire chaperones door time-lapse video microscopie. Het protocol vatbaar is voor cel synchronisatieprocedures en het gebruik van commercieel verkrijgbare baculovirus voor co-expressie van lage niveaus van fluorescente markers, met minimale invloed op de normale actine gebaseerde en spindel dynamiek tijdens mitotische progressie. We de veelzijdigheid van de werkwijze die toepasbaar is muis C2C12 cellen, "moeilijk te transduceren" zonder significante invloed op myoblast differentiatie tot myotubes in vitro tonen verder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een werkwijze waarmee depletie-rescue experimenten uit te voeren, die van toepassing zijn functionele analyses van celbiologische processen die bijzonder gevoelig zijn voor overexpressie van eiwitten die de stoichiometrie en dynamiek van eiwitcomplexen en macromoleculaire structuren is. Mitotische celdeling is een extreem voorbeeld van fijn afgestemde cel morfodynamiek de meest dramatische en samenhangende verandering in de totale structuur van een cel omvat. Adenofection gebruikt in combinatie met c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research (Grant no 7077), and by the Bellini Foundation and Roby Fondazione.
Materials
| C2C12 Mouse Myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| Adenovirus custom design | Welgen | Custom design | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10582 | |
| CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10614 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher | 12483-020 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glass bottom dishes, 35mm | MatTek Corperation | P35G-1.5-20-C Case | |
| HeLa-RFP-H2B | Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada | Klebig C et al. 2009 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| Horse Serum, New Zealand | Thermo Fisher | 16050-122 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher | 13778-150 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha | Wisent | 310-101-CL | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides | Thermo Fisher | 12000-022 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red | Thermo Fisher | 41061-029 | |
| Na2HPO4 | Biobasic | S0404 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher | 11058-021 | |
| rAVCMV-LifeAct-TagGFP2 | IBIDI | 60121 | |
| siRNA duplexes | Dharmacon | Custom design | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Trypsine 2.5% | Thermo Fisher | 15090-046 |
Referências
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).
- Natarajan, K., Rajala, M. S., Chodosh, J. Corneal IL-8 expression following adenovirus infection is mediated by c-Src activation in human corneal fibroblasts. J Immunol. 170 (12), 6234-6243 (2003).
- Yousuf, M. A., et al. Caveolin-1 associated adenovirus entry into human corneal cells. PLoS One. 8 (10), e77462 (2013).
- Morton, P. E., Hicks, A., Nastos, T., Santis, G., Parsons, M. CAR regulates epithelial cell junction stability through control of E-cadherin trafficking. Sci Rep. 3, 2889 (2013).
- Carra, S., Seguin, S. J., Lambert, H., Landry, J. HspB8 chaperone activity toward poly(Q)-containing proteins depends on its association with Bag3, a stimulator of macroautophagy. J Biol Chem. 283 (3), 1437-1444 (2008).
- Fuchs, M., et al. Identification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction. Biochem J. 425 (1), 245-255 (2010).
- Rosati, A., Graziano, V., De Laurenzi, V., Pascale, M., Turco, M. C. BAG3: a multifaceted protein that regulates major cell pathways. Cell Death Dis. 2, e141 (2011).
- Guilbert, S. M., Tanguay, R. M., Hightower, L. E., et al. . The Big Book of Small Heat Shock Proteins. , 435-456 (2015).
- Fasbender, A., et al. Complexes of adenovirus with polycationic polymers and cationic lipids increase the efficiency of gene transfer in vitro and in vivo. J Biol Chem. 272 (10), 6479-6489 (1997).
- Toyoda, K., et al. Cationic polymer and lipids enhance adenovirus-mediated gene transfer to rabbit carotid artery. Stroke. 29 (10), 2181-2188 (1998).
- Fasbender, A., et al. Incorporation of adenovirus in calcium phosphate precipitates enhances gene transfer to airway epithelia in vitro and in vivo. J Clin Invest. 102 (1), 184-193 (1998).
- Fuchs, M., et al. A Role for the Chaperone Complex BAG3-HSPB8 in Actin Dynamics, Spindle Orientation and Proper Chromosome Segregation during Mitosis. PLoS Genetics. 11 (10), e1005582 (2015).
- Champagne, C., Landry, M. C., Gingras, M. C., Lavoie, J. N. Activation of adenovirus type 2 early region 4 ORF4 cytoplasmic death function by direct binding to Src kinase domain. J Biol Chem. 279 (24), 25905-25915 (2004).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Takahashi, A., et al. Myogenic Akt signaling regulates blood vessel recruitment during myofiber growth. Mol Cell Biol. 22 (13), 4803-4814 (2002).
- Murray, T. V., et al. A non-apoptotic role for caspase-9 in muscle differentiation. J Cell Sci. 121 (Pt 22), 3786-3793 (2008).
- Terada, K., Misao, S., Katase, N., Nishimatsu, S., Nohno, T. Interaction of Wnt Signaling with BMP/Smad Signaling during the Transition from Cell Proliferation to Myogenic Differentiation in Mouse Myoblast-Derived Cells). Int J Cell Biol. 2013, 616294 (2013).
- Hindi, S. M., Tajrishi, M. M., Kumar, A. Signaling mechanisms in mammalian myoblast fusion. Sci Signal. 6 (272), re2 (2013).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
