Adenofection : 고갈-구조 실험에 의해 세포 Morphodynamics 분자 샤페론의 역할을 공부하는 방법
Summary
We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.
Abstract
이러한 유사 분열 및 세포 분화 등 세포 과정은 크게 세포 골격 구조의 적절한 리모델링에 의존하는 세포 모양의 변화에 의해 지배된다. 이는 주어진 시간과 장소에서 고차 고분자 구조의 조립 분해, 단백질의 과발현에 의한 교란에 특히 민감한 방법을 포함한다. 근처 대 정상 세포 형태를 단백질 항상성을 유지하고 유지할 수있는 방법은 세포 과정의 넓은 범위에서 목적 단백질의 기능적 기여도를 결정하는 것이 매우 바람직하다. RNA 간섭에 기초하여 과도 플리 구조 실험은 단백질의 기능 및 구조적 요구를 분석하기위한 강력한 방법이다. 그러나, 생리 학적 수준의 최소 편차를 갖는 목적 단백질의 재 도입이 어려운 과제이다. 여기에서 우리는 분자 보호자의 역할을 연구하기 위해 개발 된 방법이라고 adenofection을 설명D 분열하는 세포의 정상적인 동작 파트너 액틴 개조와의 관계. HeLa 세포는 siRNA 이중 가닥의 3'UTR 영역 타겟팅 BAG3 고갈되었다. GFP-태그 BAG3 단백질은 형질 전환 시약에 결합하는 재조합 아데노 바이러스를 사용하여 세포의> 75 %로 동시에 재 도입 하였다. Adenofection는 스트레스 반응의 부재, BAG3 고갈 HeLa 세포에 가까운 생리적 수준 BAG3-GFP 단백질을 발현 할 수 있었다. 이펙트 내인성 열 쇼크 단백질 샤페론 단백질 항상성의 주요 응력 – 유도 조절기의 레벨에서 관찰되지 않았다. 또한, 세포 형질 형질시 형광 마커의 발현을 구동 배큘로 바이러스를 첨가함으로써, 시간 경과에 의해 미세한 분열 세포 역학 해부 수 정상적인 분열 진행 최소 교란으로 분석한다. Adenofection은 근육 모세포은 diff의 기능 분석을위한 하드에 감염시킬 마우스 세포에도 적용하고, 적합myotubes에 erentiation. 따라서 adenofection 구조 – 기능은 고차 세포 골격 역학에 의존하는 중요한 생물학적 과정에 관여하는 단백질의 분석을 수행하기 위해 다양한 방법을 제공한다.
Introduction
포유 동물 세포에서 유전자 발현의 불 활성화 작용은 단백질의 기능을 해부 금 표준이다. 새로 아연 손가락 클레아 제와 같은 특정 사이트 클레아 제의 사용을 기반으로 게놈 편집 기술을 개발하고 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR)은 / CAS9 이제 타겟 유전자 삭제 및 돌연변이 1, 2와 세포주의 생성을 할 수 있습니다. 이 새로운 접근 방식은 우리가 단백질의 기능과 인간 질병의 유전에 대한 우리의 이해를 공부하는 방법을 혁신해야합니다. 일부 경우에서, 그러나, 장기 또는 완전한 유전자 녹아웃 바람직하지 않다 이차 전지 및 보상 메커니즘을 유발할 수있다. 유전자 조작 된 세포주의 생성은 또한 제한된 증식 능력 때나 다양한 세포 유형의 돌연변이의 큰 집합의 스크리닝 받고자 일차 세포 배양 물을 처리 할 때 제한 될 수있다. 이는 종종 셀 B의 의존성을 결정하기 위해 필요한단백질의 구조적 요구 사항에 대한 학적 처리. 이를 위해 다양한 세포 배경 일시적 플리 구조 실험 있도록 RNA 간섭에 의한 가역적 최저 여전히 구조 기능 관심 3의 단백질 분석을 수행하는 간단하고 강력한 접근 남아있다. 그러나, 이러한 접근법의 주요 단점은 어려움 효율적인 침묵을 달성하고, 세포 집단의 대부분에 가까운 생리적 수준의 관심 또는 그의 변이체의 단백질을 재 도입하는 것이다. 이 단백질 – 단백질 상호 작용에 대한 예를 들어 세포 인구 기반 분석에서 본 것과, 단일 세포 (hypomorphic 표현형)의 수준에서 볼 기능적 효과의 상관 관계를 시도 포괄적 인 연구를 활성화하기 위해 매우 중요합니다.
고전적인 형질 전환 방법을 사용하여, 하나는 거의 세포의 큰 집단에서 외인성 단백질의 균질 낮은 발현을 달성 할 수 없다. 재조합 바이러스와 세포의 형질 도입아데노 바이러스처럼 자주 외래 단백질의 더 정규화 된 표현을 가능하게한다. 그러나 아데노 흡수는 비 – 인간 세포에서 존재하지 않거나 약하게 일부 인간 세포 유형에서 발현되는 CAR 수용체에 의해 제한된다. 또한, 아데노 바이러스의 세포 엔트리는 셀 형상 및 밀착성 4-6 조절 신호 전달 경로 활성화한다. 세포 morphodynamics의 규제 메커니즘을 연구 할 때 분명히 바람직하지 않다. 우리는 세포 분열과 굴지 역학에, 보호자 단지, BAG3 – HSPB8의 기능 분석에 착수 할 때 우리는이 문제에 직면했다. 개척 작업은 스트레스 7,8 중에 단백질 품질 관리와 자식 작용이 보호자 단지의 역할을 설명했다. 이러한 연구의 대부분은, 그러나, 일반적으로 샤페론은 스트레스를받는 동안 상향 조절되는 것으로 가정하면, 단백질의 과발현에 의존했다. 이것은 HSPB8 복잡한에 여부 BAG3의 질문에 열려있다, 일을 표현 분열하는 세포의 정상적인 작동에 기여할 수많은 암 세포 유형 9 등 ESE 샤페론. 특히, 보호자 단지는 HSPB의 보호자 및 세포 골격 역학 (10) 사이의 새로운 연결 주어진 큰 관심이었다 유사 분열 진행을 제어 액틴 기반 구조의 리모델링에 기여하는지 여부. 이 문제를 해결하기 위해 유사 분열 진행 또는 휴대 형태 방해하지 것이고, 셀 형상 변경을 규제 고분자 복합체의 역학 이차 교란을 방지하기 위해 단백질 항상성을 유지할 것이다 플리 구조 실험을위한 효과적인 방법을 개발하고자 하였다 . 따라서 이상적으로, 관심있는 유전자의 고갈 – 추가 백을 동시에 수행해야합니다.
양이온 성 지질 또는 중합체와 아데노 바이러스의 착물의 사용은 시험 관내 및 생체 11,12 유전자 전달을 촉진하기 위해 기술되었다. 예를 들어, 인산 칼슘 (CAPI)을 갖는 석출물을 보인다CAR 독립적 인 통로 (13)를 통해 바이러스 바인딩 항목을 강화 아데노 바이러스. 실제로, 우리는 양이온 성 화합물과 아데노 바이러스 계 형질 세포 및 형질 전환을 조합하면 플리 구조 실험의 효율을 향상시킬 수 있다는 것을 발견했다. 이것은 대부분의 근처 내인성 수준에서 외인성 단백질의 발현을 조절하기 위해 더 넓은 윈도우의 세포주 및 목적 유전자와 이익에 따라, 우리는 20 배로 -3-하여 바이러스의 양을 낮출 수 세포 형태에 미치는 영향을 최소화하여 원하는 세포 인구의. 이러한 조건 하에서, 또한 내인성 단백질의 발현 (> 75 %)의 고효율 녹다운을 얻을 수있다. 우리는 이에 생리적 소유주의 기능을 분석하는 방법이 적합 단계에 의해 방법 단계를 설명하고 열 충격 단백질 가족의 스트레스 유발 보호자의 변경 수준에 의해 평가로 단백질 항상성이 크게 교란되지 않고 있다는 증거를 제공시간 경과 비디오 현미경에 의한 분자 보호자의 제작. 이 프로토콜은 셀 동기화 절차와 유사 분열 진행 중 정상 액틴 기반 및 스핀들 역학과 최소한의 간섭 형광 마커의 낮은 수준의 공동 발현을위한 상업적으로 이용 가능한 배큘로 바이러스의 사용 의무입니다. 우리는 또한 체외에서 myotubes에 근원 세포의 분화에 유의 한 영향을 마우스 C2C12 세포를, "형질 도입하기 어렵다"에 적용 할 수있는 방법의 다양성을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서는 화학량 론 및 단백질 복합체 및 거대 구조 역학에 영향을 미치는 단백질의 과발현에 특히 민감한 세포 생물학적 과정의 기능적 분석에 적용 가능하다 플리 구조 실험이 수행 될 수 있도록하는 방법을 설명했다. 유사 분열 세포 분열은 세포의 전체 구조에서 가장 극적이고 아름다운 변화를 포함 미세 조정 세포 morphodynamics의 극단적 인 예입니다. 세포 이미징을위한 굴지 및 tubulin의 마커?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research (Grant no 7077), and by the Bellini Foundation and Roby Fondazione.
Materials
| C2C12 Mouse Myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| Adenovirus custom design | Welgen | Custom design | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10582 | |
| CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10614 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher | 12483-020 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glass bottom dishes, 35mm | MatTek Corperation | P35G-1.5-20-C Case | |
| HeLa-RFP-H2B | Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada | Klebig C et al. 2009 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| Horse Serum, New Zealand | Thermo Fisher | 16050-122 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher | 13778-150 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha | Wisent | 310-101-CL | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides | Thermo Fisher | 12000-022 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red | Thermo Fisher | 41061-029 | |
| Na2HPO4 | Biobasic | S0404 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher | 11058-021 | |
| rAVCMV-LifeAct-TagGFP2 | IBIDI | 60121 | |
| siRNA duplexes | Dharmacon | Custom design | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Trypsine 2.5% | Thermo Fisher | 15090-046 |
Referências
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