Adenofection: Une méthode pour étudier le rôle des chaperons moléculaires dans Cellular Morphodynamique par Experiments Depletion-sauvetage
Summary
We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.
Abstract
processus cellulaires tels que la mitose et la différenciation des cellules sont régis par des changements dans la forme des cellules qui reposent en grande partie sur une bonne remodelage des structures du cytosquelette cellulaire. Ceci implique l'assemblage de démontage des structures macromoléculaires d'ordre supérieur à une heure et l'endroit donné, un processus qui est particulièrement sensible aux perturbations causées par la surexpression de protéines. Les méthodes qui peuvent préserver la protéine homéostasie et de maintenir la morphologie proche de la normale cellulaire sont hautement souhaitables pour déterminer la contribution fonctionnelle d'une protéine d'intérêt dans un large éventail de processus cellulaires. Transitoires expériences déplétion de sauvetage basés sur l'interférence ARN sont des approches puissantes pour analyser les fonctions des protéines et des exigences structurelles. Cependant, la réintroduction de la protéine cible avec un écart minimum à son niveau physiologique est un véritable défi. Nous décrivons ici une méthode appelée adenofection qui a été développé pour étudier le rôle des chaperons moléculaires d'unpartenaires d dans le fonctionnement normal des cellules en division et la relation avec l'actine remodelage. Les cellules HeLa ont été épuisées de BAG3 avec duplex siRNA ciblant la région 3'UTR. BAG3 protéines GFP étiqueté ont été réintroduites simultanément dans> 75% des cellules en utilisant des adénovirus recombinants couplés à des réactifs de transfection. Adenofection a permis d'exprimer des protéines BAG3-GFP aux niveaux physiologiques proches dans les cellules HeLa appauvries de BAG3, en l'absence d'une réponse de stress. Aucun effet n'a été observé sur les niveaux de endogènes chaperons de protéines de choc thermique, les principaux régulateurs inductibles par le stress de la protéine homéostasie. En outre, en ajoutant de baculovirus qui contrôlent l'expression des marqueurs fluorescents, au moment de la transfection cellulaire de transduction, on peut disséquer la dynamique des cellules en mitose par microscopie time-lapse analyse avec une perturbation minimale de la progression mitotique normale. Adenofection est également applicable à des cellules difficiles à infecter la souris, et adaptés aux analyses fonctionnelles des myoblastes différentiation en myotubes. Ainsi adenofection fournit un procédé polyvalent pour effectuer des analyses structure-fonction de protéines impliquées dans les processus biologiques sensibles qui reposent sur la dynamique du cytosquelette d'ordre supérieur.
Introduction
l'inactivation fonctionnelle de l'expression génique dans des cellules de mammifères est l'étalon-or pour disséquer les fonctions des protéines. Nouvellement développé des technologies de l' édition du génome basé sur l'utilisation des nucléases spécifiques au site tels que des nucléases à doigt de zinc et en grappes régulièrement espacées répétitions palindromiques courtes (CRISPR) / cas9 permettent maintenant la génération de lignées cellulaires avec délétion du gène ciblé et la mutation 1,2. Ces nouvelles approches devraient révolutionner la façon dont nous sommes en train d'étudier la fonction des protéines et notre compréhension de la génétique des maladies humaines. Dans certains cas, cependant, à long terme ou knockout gène complet ne sont pas souhaitables et peuvent provoquer des mécanismes de compensation des cellules secondaires. La génération de lignées cellulaires génétiquement modifiées peuvent aussi être limitatifs en traitant des cultures de cellules primaires avec une capacité de prolifération limitée, ou lors de la projection d'un grand nombre de mutations dans divers types cellulaires est recherchée. Ceci est souvent nécessaire pour déterminer la dépendance d'une cellule bprocessus iologiques sur les exigences structurelles d'une protéine. À cette fin, knockdown réversible par interférence ARN qui permet transitoires expériences déplétion sauvetage dans divers milieux cellulaires reste encore une approche simple et puissant pour effectuer des analyses structure-fonction d'une protéine d'intérêt 3. Cependant, un inconvénient majeur de cette approche est la difficulté à atteindre le silençage efficace et de réintroduire la protéine d'intérêt ou de ses variantes à des niveaux proches physiologiques dans une majorité de la population de cellules. Ceci est crucial pour permettre des études approfondies qui tentent d'établir une corrélation entre les effets fonctionnels observés au niveau des cellules individuelles (phénotype hypomorphic) avec ceux observés dans les essais basés sur la population de cellules, par exemple sur les interactions protéine-protéine.
En utilisant des méthodes de transfection classiques, on peut difficilement obtenir une expression homogène et faible de protéines exogènes dans une grande population de cellules. Transduction des cellules avec des virus recombinantscomme adenovirus permet souvent une expression plus normalisée de protéines exogènes. Or, l'absorption d'adénovirus est limitée par le récepteur CAR, qui est absente dans les cellules non humaines ou seulement faiblement exprimé dans certains types de cellules humaines. En outre, l'entrée cellulaire des adénovirus active des voies qui régulent la forme des cellules et l' adhérence 4-6 signalisation. Ceci est évidemment pas souhaitable lors de l'étude des mécanismes de régulation de la morphodynamique cellulaires. Nous avons été confrontés à cette problématique lorsque nous avons entrepris des analyses fonctionnelles d'un complexe de chaperon, BAG3-HSPB8, dans la division cellulaire et de la dynamique de l'actine. Un travail de pionnier a décrit un rôle pour ce complexe chaperon en protéines contrôle de la qualité et de l' autophagie au cours du stress 7,8. La plupart de ces études, cependant, appuyé sur surexpression de la protéine, en supposant que les chaperons sont normalement régulés à la hausse au cours du stress. Cela a laissé ouverte la question de savoir si BAG3, dans un complexe avec HSPB8, peut contribuer à l'exploitation normale des cellules en division exprimant echaperons ese comme de nombreux types de cellules cancéreuses 9. En particulier, si le complexe chaperon contribue au remodelage des structures à base de l' actine qui contrôlent la progression mitotique était d' un grand intérêt, étant donné les liens émergents entre chaperons hspB et la dynamique du cytosquelette 10. Pour résoudre ce problème, nous cherchions à développer une méthode efficace pour les expériences déplétion de sauvetage qui ne serait pas interférer avec la progression mitotique ou la morphologie cellulaire, et qui préserverait la protéine homéostasie pour éviter une perturbation secondaire de la dynamique des complexes macromoléculaires de régulation des changements de cellules forme . Ainsi, idéalement, l'épuisement-add-back du gène d'intérêt doit être réalisée simultanément.
L'utilisation de complexes d'adénovirus avec un polymère cationique ou de lipides a été décrite pour favoriser le transfert de gènes in vitro et in vivo 11,12. Par exemple, le phosphate de calcium (ICPA) semble former un précipité avecadénovirus qui améliorent la liaison du virus d'entrée par l' intermédiaire d' une voie de CAR-indépendante 13. En effet, nous avons constaté que la combinaison de transduction et de transfection cellulaire à base d'adénovirus avec des composés cationiques, pourrait améliorer l'efficacité des expériences d'appauvrissement de sauvetage. Cela nous a permis d'abaisser les quantités de virus par 3 à 20 fois, en fonction de la lignée cellulaire et le gène d'intérêt, et de bénéficier d'une fenêtre plus large afin d'ajuster l'expression de protéines exogènes à des niveaux proches endogènes dans la majorité d'une population de cellules d'intérêt avec un impact minimal sur la morphologie cellulaire. Dans ces conditions, on pourrait aussi obtenir une grande knockdown de l'efficacité de l'expression de protéine endogène (> 75%). Nous décrivons par la présente l'étape de procédé par étape et fournir la preuve que la protéine homéostasie est pas significativement perturbée évaluée par les niveaux inchangés de chaperons induites par le stress de la famille des protéines de choc thermique, ce qui rend la méthode appropriée pour les analyses fonctionnelles de la ro physiologiquele des chaperons moléculaires par time-lapse vidéo microscopie. Le protocole se prête à une procédure de synchronisation de cellule et à l'utilisation de baculovirus disponibles dans le commerce pour la co-expression de faibles taux de marqueurs fluorescents, avec un minimum d'interférence avec la dynamique à base d'actine et de la broche normale lors de la progression mitotique. Nous montrons en outre la versatilité de la méthode, qui est applicable à «difficile à transduction" cellules C2C12 de souris, sans impact significatif sur la différenciation des myoblastes en myotubes in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons décrit un procédé permettant des expériences d'appauvrissement de sauvetage à effectuer, qui est applicable à l'analyse fonctionnelle des processus biologiques cellulaires qui sont particulièrement sensibles à la surexpression de protéines qui affectent la stoechiométrie et la dynamique des complexes protéiques et des structures macromoléculaires. la division cellulaire mitotique est un exemple extrême de morphodynamique cellulaires finement réglé qui implique les changements les p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research (Grant no 7077), and by the Bellini Foundation and Roby Fondazione.
Materials
| C2C12 Mouse Myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| Adenovirus custom design | Welgen | Custom design | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10582 | |
| CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10614 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher | 12483-020 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glass bottom dishes, 35mm | MatTek Corperation | P35G-1.5-20-C Case | |
| HeLa-RFP-H2B | Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada | Klebig C et al. 2009 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| Horse Serum, New Zealand | Thermo Fisher | 16050-122 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher | 13778-150 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha | Wisent | 310-101-CL | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides | Thermo Fisher | 12000-022 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red | Thermo Fisher | 41061-029 | |
| Na2HPO4 | Biobasic | S0404 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher | 11058-021 | |
| rAVCMV-LifeAct-TagGFP2 | IBIDI | 60121 | |
| siRNA duplexes | Dharmacon | Custom design | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Trypsine 2.5% | Thermo Fisher | 15090-046 |
Referências
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