Fremstilling af CD4<sup> +</sup> T-celler til analyse af GD3 og GD2 gangliosidet Membrane Expression ved mikroskopi
Summary
Vi beskriver en standard antistof farvningsprotokollen til anvendelse i mikroskopi for at bestemme membranen ekspression og lokalisering af gangliosider i hvilende og aktiverede humane naive CD4 + T-celler. Også beskrevet er real-time PCR eksperimenter med <40.000 celler, som ikke kræver yderligere lave input RNA kits.
Abstract
De heri beskrevne for aktivering af naive CD4 + -T-celler metoder i suspension og deres tilslutning i dækglas til konfokal mikroskopi analyse tillader rumlige lokalisering og visualisering af gangliosider er involveret i CD4 + T-celleaktivering, at komplement ekspressionsprofil eksperimenter såsom flowcytometri, western blotting eller real-time PCR. Kvantificeringen af gangliosid ekspression gennem flowcytometri og deres cellulære lokalisering gennem mikroskopi kan opnås ved anvendelse af anti-gangliosid-antistoffer med høj affinitet og specificitet. Ikke desto mindre en passende håndtering af celler i suspension involverer behandling af dyrkningsplader at fremme den nødvendige vedhæftning kræves til fluorescens eller konfokal erhvervelse mikroskopi. I dette arbejde beskriver vi en protokol til bestemmelse af GD3 og GD2 gangliosid udtryk og colokalisering med TCR under naive CD4 + T-celle-aktivering. Også, real-time PCR-forsøg under anvendelse af <40.000 celler er beskrevet til bestemmelse af GD3 og GM2 / GD2 synthase gener, hvilket viser, at genet analyse eksperimenter kan udføres med et lavt antal celler og uden behov for yderligere lavinput RNA kits.
Introduction
CD4 + T-celler dirigerer immunresponsen gennem deres effektorfunktioner efter aktivering af antigen-præsenterende celler 1. Undersøgelsen af de cellulære mekanismer, der er moduleret under aktivering tillader indsigt i en grundlæggende proces med immunfunktion. Imidlertid kan studiet af naive CD4 + T-celler være kompliceret, fordi de repræsenterer en meget lille population af celler i blodet periferi 2.
Gennem fluorescens mikroskopi flere rapporter har undersøgt lokaliseringen af forskellige molekyler, der er involveret i CD4 + T-celleaktivering, hovedsagelig proteiner associeret til plasmamembranen 3. Gangliosiderne er sialinsyre indeholdende glycosphingolipider og selv om de er blevet grundigt undersøgt i nerveceller, hvor de er rigelige, andre celler såsom immunceller også udtrykker gangliosider med biologisk relevante funktioner 4,5. Vi har tidligere rapporteret that under aktivering af humane naive CD4 + -T-celler der er en opregulering af α2,8 sialyltransferase ST8Sia 1 (GD3-syntase) og GM2 / GD2 syntase, der inducerer betydelig overflade neoexpression af GD2 og opregulering af GD3-gangliosid 6. Yderligere undersøgelse af GD3, GD2 og andre gangliosider i immunceller er nødvendigt at supplere en protein-baserede delvis visning af immunforsvar.
Almindeligvis er studiet af gangliosid ekspression baseret på teknikker som tyndtlagskromatografi (TLC) 7, men denne teknik tillader ikke den rumlige lokalisering af gangliosider på plasmamembranen eller i subcellulære afsnit, begrænser den biologiske analyse.
I dette arbejde, beskriver vi en protokol for antistof-medieret identifikation og lokalisering af GD3 og GD2 gangliosiderne i humane naive CD4 + T-celler og PBMC'er efter anti-CD3 / anti-CD28-aktivering. Med denne protokol det jegs også muligt at analysere genet og molekylære udtryk for gangliosider i et lavt antal celler i suspension, med køb af høj kvalitet billeder 6, i betragtning af den lille størrelse af lymfocytter (9 um).
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrevne protokol kan anvendes til at lokalisere gangliosider eller proteiner i cellesuspensioner af CD4 + T-celler eller andre immunceller (f.eks PMBC'erne, figur 5) startende fra et lille antal celler. På grund af den lille størrelse af T-celler og ikke-klæbende egenskaber, erhvervelse af fluorescens mikroskopiske billeder resulterer i dårlig information eller lav kvalitet, hvis cellerne ikke korrekt overholdt.
Denne protokol kombineret med…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. José Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Temática Glicociencia en Salud – CONACYT (253596).
Materials
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
References
- Mazzon, C., Viola, A. From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse. Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).
- Hamann, D., Pa Baars, ., Hooibrink, B., van Lier, R. W. Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms. Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).
- Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation. Biomed Res Int. , 276498 (2013).
- Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation. Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).
- Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).
- Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters. Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).
- Müthing, J. TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids. Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- O’Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).
- Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).
- Marconi, S., Acler, M., et al. Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients. Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).
- Park, J. E., Wu, D. Y., et al. Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand. Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).
- Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis. Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).
- Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex. J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).
- Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control. Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).
- Yamashiro, S., Okada, M., et al. Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes. Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).
- Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes. Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).
- Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody. J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).
