CD4 hazırlanması<sup> +</sup> Mikroskopi GD3 ve GD2 Gangliozidleri Membran İfade Analizi T hücreleri
Summary
Istirahat bölgesindeki gangliosidler ve aktive edilmiş insan naif CD4 + T hücrelerinin membran ekspresyonunu ve sınırlandırılmasını belirlemek için mikroskopla kullanılmak için bir standart antikor boyama protokolü tarif eder. Ayrıca gerçek zamanlı PCR deneyleri <ek düşük giriş RNA kitleri gerekmez 40.000 hücreleri kullanarak tarif edilir.
Abstract
Süspansiyonda saf CD4 + T hücrelerinin aktivasyonu için, burada tarif edilen yöntem ve konfokal mikroskopi analizi için lamelleri bunların yapışma deneyleri profil komplemanın sentezleme akış sitometrisi gibi, CD4 + T hücresi aktivasyonunda rol gangliosidler uzamsal lokalizasyonu ve görselleştirme izin batı blotting ya da gerçek-zamanlı PCR. akış sitometrisi ve mikroskopi yoluyla hücresel lokalizasyon yoluyla gangliosid ifadesinin ölçümü, yüksek yakınlık ve özgüllük ile anti-gangliosid antikorların kullanılması ile elde edilebilir. Bununla birlikte, süspansiyon içinde hücrelerin yeterli bir kullanım floresan veya konfokal mikroskopi edinimi için gerekli olan yapışma teşvik etmek için kültür plakaları muamele edilmesini içerir. Bu çalışmada, saf CD4 + T hücresi aktivasyonu sırasında GD3 ve GD2 gangliozid ekspresyonunu ve TCR ile ko saptanması için bir protokol açıklar. Ayrıca, gerçek-t<40,000 hücre kullanılarak ime PCR deneyleri hücre düşük sayıda ilave düşük giriş RNA kitleri gerek kalmadan gerçekleştirilebilir bu gen analiz deneyleri gösteren, GD3 ve GM2 / GD2 sintaz genlerinin belirlenmesi için tarif edilmiştir.
Introduction
CD4 + T hücreleri, antijen sağlayan hücreler 1 tarafından aktive edildikten sonra, bunların etki edici fonksiyonları ile bağışıklık yanıtını yönlendirirler. etkinleştirme sırasında modüle hücresel mekanizmaların çalışma bağışıklık fonksiyonunun temel bir süreci içine fikir verir. Kan çevre 2 hücrelerinin çok küçük bir popülasyonu temsil Ancak, saf CD4 + T hücrelerinin çalışması zor olabilir.
Floresan mikroskobu aracılığıyla çeşitli raporlar CD4 + T hücresi aktivasyonu yer alan farklı moleküller plazma membranında 3 ile ilişkili temel protein lokalizasyonu inceledik. Gangliositler sialik asit içeren glikosfingolipidler ve onlar yaygın böyle bağışıklık hücreleri gibi bol, diğer hücreler sinir hücreleri incelenmiştir rağmen, aynı zamanda biyolojik ilgili fonksiyonları 4,5 ile gangliositler ifade eder. Biz daha önce tha bildirdiST8Sia 1 (GD3 sentaz) ve GM2 / GD2 sentaz sıyalıltransferaz α2,8 bir düzenlenmesi görülür, insan naif CD4 + T hücrelerinin aktivasyonu sırasında bulunan t, yani GD2 önemli yüzey neoexpression ve GD3 gangliozide 6 düzenlenişini uyarmaktadır. bağışıklık hücrelerinde GD3, GD2 ve gangliosidler daha başka çalışma, bağışıklık fonksiyonunun bir protein bazlı kısmi görünümü güzelleştirmek için gereklidir.
Genel olarak, gangliosid ifade çalışması, ince tabaka kromatografisi (TLC), 7 gibi teknikler dayanan, ancak bu teknik, biyolojik analizi sınırlayıcı plazma membranı veya hücre içi bölümlerinde gangliosidler uzamsal lokalizasyonu izin vermez.
Bu çalışmada, anti-CD3 / anti-CD28 aktivasyonundan sonra, insan naif CD4 + T hücreleri ve PBMC'de GD3 ve GD2 antikor aracılı tanımlama ve lokalizasyonu için bir protokol açıklamaktadır. Bu protokolü i ilelenfositlerin küçük boyutlu (9 mm) dikkate alınarak, yüksek kaliteli görüntüler 6 satın alınmasından sonra, süspansiyon hücrelerin düşük sayıda gangliosidler geni ve moleküler ifadesini analiz etmek de mümkündür.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan protokol, CD4 + T hücreleri ya da küçük bir hücre sayısı başlayarak, diğer bağışıklık hücreleri (örneğin, ekspresyonu analiz edilmiştir, Şekil 5) hücre süspansiyonlarında gangliosidler veya protein lokalize etmek için de kullanılabilir. Çünkü T hücreleri ve yapışmaz özellikleri küçük boyutu, kötü bilgi veya düşük kalitede floresan mikroskobik görüntüleri sonuçların elde edilmesi hücreleri doğru yapıştırılır de?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. José Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Temática Glicociencia en Salud – CONACYT (253596).
Materials
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
References
- Mazzon, C., Viola, A. From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse. Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).
- Hamann, D., Pa Baars, ., Hooibrink, B., van Lier, R. W. Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms. Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).
- Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation. Biomed Res Int. , 276498 (2013).
- Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation. Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).
- Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).
- Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters. Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).
- Müthing, J. TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids. Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- O’Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).
- Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).
- Marconi, S., Acler, M., et al. Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients. Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).
- Park, J. E., Wu, D. Y., et al. Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand. Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).
- Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis. Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).
- Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex. J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).
- Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control. Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).
- Yamashiro, S., Okada, M., et al. Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes. Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).
- Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes. Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).
- Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody. J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).
