We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.
Antistoffer mot neuraminidase (NA), det andre mest tallrike overflateprotein på influensavirus, bidra til beskyttelse mot influensa. Tradisjonelle metoder for å måle NA inhibering (NI) antistofftitere er ikke praktiske for rutinemessig serologi. Denne protokollen beskriver enzymbundet lectin assay (Ella), et praktisk alternativ metode for å måle NI titere som er utført i 96-brønners plater belagt med et stort glykoprotein substrat, fetuin. NA kløyver terminal sialinsyrer fra fetuin, utsette den nest siste sukker, galaktose. Jordnøttagglutinin (PNA) er et lektin med spesifisitet for galaktose og derfor utstrekningen av desialylering kan kvantifiseres ved hjelp av et PNA-pepperrot-peroksidase-konjugat, etterfulgt av tilsetning av et kromogent substrat peroksidase. Den optiske densitet som måles er proporsjonal med NA-aktivitet. For å måle NI antistofftitere, blir seriefortynninger av serum inkubert ved 37 ° CO / N på fetuin-belagte plater med et fast beløp of NA. Den resiproke verdi av den høyeste serumfortynning som gir ≥50% inhibering av NA-aktivitet er angitt som NI antistofftiter. Den ELLA gir et praktisk format for rutinemessig evaluering av humane antistoffresponser etter influensainfeksjon eller vaksinasjon.
Neuraminidase (NA) er et glykoprotein som uttrykkes på overflaten av influensavirioner. Dets enzymaktivitet er nødvendig for frigjøring av nylig dannede viruspartikler fra infiserte celler 1,2. Antistoffer som hemmer NA aktivitet redusere Virustitere og sykdomssymptomer i dyremodeller 3 og korrelerer med motstand mot sykdom hos mennesker 4. En økning i NA hemming (NI) titer etter vaksinasjon kan derfor tjene en indikator på vaksinens effekt, men mange tidligere influensa immunogenisitetsstudier ikke inkluderte dette endepunktet fordi den tradisjonelle analysen for å måle NI antistofftiter er upraktisk for rutine serologi.
Den tradisjonelle metoden for å måle NI titere er basert på å kvantifisere mengden av sialinsyre som spaltes fra glykokonjugater av NA 1. Denne metode er ofte referert til som tiobarbitursyre (TBA) metode, bruker farlige kjemikalier for å konvertere sialinsyre acid til en kromofor som kan kvantifiseres ved spektrometri. Analysen er ikke egnet for testing av stort antall prøver, fordi de enkelte glass-rør blir brukt, noe som gjør det tungvint analysen. Miniatyrisering av analysen til en 96-brønners plater gir en mer praktisk format 5, men dette assay krever fortsatt bruk av giftige kjemikalier og er derfor ikke ideelt.
En alternativ analyse for å måle NI antistofftitere ble utviklet av Lambre et al. 6. Denne analyse kvantifiserer enzymaktivitet ved å måle mengden av det nest siste sukker av glykoproteiner, galaktose, som blir eksponert når sialinsyre er utgitt av NA. Siden peanøtt-agglutinin (PNA) binder seg spesifikt til galaktose, kan en PNA-pepperrot peroksydase (HRPO) konjugat anvendes for å oppnå en kolorimetrisk utlesning. Den optiske densitet som måles er derfor proporsjonal med NA-aktivitet i prøven. NI-titere blir målt ved å bestemme den høyeste fortynningenav serum som inhiberer minst 50% av NA-aktivitet. Dette enzym-bundet lektin assay (Ella) blir utført i 96-brønners plater belagt med fetuin, et sterkt glykosylert serumprotein, som substratet for NA.
En viktig faktor for analyser som måler NI titere, er kilden til NA. Dette er fordi sera fra vaksinerte eller infiserte individer inneholde antistoffer mot hemagglutinin (HA), så vel som antistoffer mot NA. Antistoffer som binder til HA kan forstyrre NA aktivitet, og derfor, for å unngå ikke-spesifikk inhibering av HA-spesifikke antistoffer, renset NA eller hel virus inneholdende et antigent-særpregede HA skal brukes i analysen. Disse virusene kan genereres av klassisk reassortment eller revers genetikk; målet er å redde et virus som inneholder HA av en undertype som ikke er relatert til målet belastning, og NA av viruset som blir studert. Analysen beskrevet i denne artikkelen, benytter influensa A-virus som er generert av revErse genetikk å inneholde HA av subtype H6 og målrettet NA fra influensa A-virus, subtyper H1N1 og H3N2 5.
Resultater generert av Ella og miniatyriserte TBA analyser viser disse metodene er sammenlignbare med tilsvarende subtype spesifisitet og sensitivitet 7. ELLA krever ikke bruk av farlige kjemikalier, og derfor er den foretrukne metode for å måle NI titer. Det er lett å utføre, med bare noen få trinn (figur 1): prøver fortynnes og overført til en fetuin-belagt plate til hvilken virus (kilden til NA) tilsettes. Platen inkuberes O / N og vasket før tilsetning av PNA-HRPO. Etter en 2 timers inkubering, er platen vasket og peroksidasesubstrat ble tilsatt; fargereaksjonen er stoppet, og endelig den optiske tettheten målt og den resiproke verdi av den prøvefortynning som resulterte i minst 50% inhibering av NA-aktivitet er rapportert som den 50% sluttpunkt titer. En intra-laboratorium studie for å vurdere reproducibility til Ella, viste at plate-til-plate variabilitet er minimal og operatør til operatør repeterbarhet resulterte i ikke mer enn to gangers forskjell i titer 7. En etterfølgende inter-laboratoriet studie av ELLA variasjon viste at analysen har god reproduserbarhet når utført i forskjellige laboratorier, og at inkludering av en standard kan ytterligere redusere variasjon i resultatene 8. Ella er egnet til å måle NI antistofftitere i serum paneler fra prekliniske og kliniske studier influensavaksine 7 og kan også brukes til å evaluere antigene forskjeller mellom NAS av influensavirus, 9.
Den enzym-bundet lektin-analysen er en praktisk metode for å måle NI antistofftitere i sera. Selv om ELLA ble beskrevet av Lambre et al., I 1990, har sin aksept som en standard serologiske testen vært nyere, med en rekke laboratorier som utfører analysen for å måle NI antistofftitre av kliniske prøver 12-16. Enkelte modifikasjoner kan gjøres til protokolltrinn uten en stor innvirkning på NI titere som måles. For eksempel kan PBS brukes som fortynningsmiddel, men det er svært nyttig å sammenligne virus titrering kurver i den anbefalte buffer (MES, pH 6,5) og PBS før en beslutning er tatt, som noen NA subtyper har redusert enzymaktivitet betraktelig på pH> 7,0. Når den optimale pH-verdien ikke er i bruk, kan den maksimale signal virus bli redusert, noe som resulterer i bruk av en overdreven mengde av antigen (dvs. virus) i analysen; under disse betingelser, kan analysen har redusert følsomhet.
noen non-spesifikk inhibering observeres når ubehandlet sera testes i Ella. Dette fjernes ved varmebehandling (56 ° C i 45 min), noe som indikerer nærværet av termolabile p-inhibitorer. Andre ikke-spesifikke inhibitorer (α og γ-klasse) av influensa HA er blitt beskrevet, spesielt i forhold til H3N2 virus hemagglutinering og infektivitet. Faktisk er ikke-spesifikk hemming også observert i Ella da H3N2 virus anvendes som kilde for NA; denne hemming fjernes ved behandling av serumprøvene med en liten mengde av sialidase 9.
Som for andre serologiske analyser, bør negative og positive kontroller inkluderes i hver analyse for å tilveiebringe et middel for å evaluere analyseytelse. Når analysen ikke har møtt akseptkriterier, bør årsaken identifisert. Tabell 1 gir en oversikt over mulige trinn i analysen som kan tas opp for å feilsøke problemer.
Den ELLA protokollen provided i denne rapporten benytter reassorterte virus som inneholder HA som stammer fra en avian virus, som kilde til NA. Dette presenterer en begrensning for å utføre analysen fordi det kreves tillatelse for å arbeide med lave patogene fuglevirus. H6Nx reassorterte virus kan deles mellom laboratoriene etter at de har blitt inaktivert. Derfor analysen kan skje gjennom samarbeid når laboratoriet genererer reassortant viruset har vist at inaktiveringen er fullført, og ved fremstillingen har beholdt sin NA aktivitet. Begrensningen av å bruke H6Nx reassorterte virus kan overvinnes ved hjelp av ikke-infeksiøse kilder til NA. For eksempel har noen laboratorier brukt renset rekombinant NA 17, mens andre har brukt viruslignende partikler (VLP) 15. Men verken rekombinant NA eller VLP er lett tilgjengelig, og derfor fortsetter vi å bruke influensavirus med et antigent feilaktige avian HA.
den tradisjonelleFremgangsmåten for å måle NI antistofftitere er ikke praktisk av flere grunner; av mest interesse er de skadelige kjemikalier som er nødvendig for å produsere en fargereaksjon. I tillegg er store volumer av prøve nødvendig, og analysen er tungvint å utføre. I motsetning til dette er Ella enkel å utføre og er i et format som tillater titrering av et rimelig antall prøver. Data fra studier som undersøkte ELLA variasjon viser at metoden gir reproduserbare resultater 7,8. Ella har derfor laget rutine måling av NI antistofftitre mulige, og det er forventet at det vil bli brukt oftere ved laboratorier gjennomføre serologiske studier.
Det er flere viktige skritt som må tas i betraktning når du utfører ELLA. For det første må ikke-spesifikke inhibitorer av NA-aktivitet fjernes. Disse inhibitorer er generelt termolabile og blir ødelagt ved varmebehandling ved 56 ° C i 45 minutter. Varmebehandling er tilstrekkelig til å fjerne ikke-spesific inhibitorer fra prøver når H6 reassorterte virus benyttes som kilde for NA, men når H3N2 virus anvendes i Ella, serumfaktorer som binder til hemagglutinin også forstyrre Ella og bør fjernes ved behandling med en liten mengde av sialidase før varmebehandling 9. For det andre, en overdreven mengde av antigen, dvs. reassortant H6Nx virus, bør ikke brukes, da dette reduserer sensitiviteten av analysen. Forsiktig titrering av virus er derfor et viktig skritt; mengden av antigen anvendt i hver analyse må gi et signal som ligger godt over bakgrunnen, og må være innenfor det lineære området av titreringskurven, dvs. må signalet (optisk densitet) være proporsjonal med viruset fortynning.
I tillegg til rutine serologi kan ELLA brukes til å vurdere antigene forskjeller mellom NAS i sesongens influensavirus. Denne informasjonen kan være svært nyttig når du velger virusstammer for inkludering ens vaksinekandidater og vil legge til rette for en større forståelse av immun press som fører til antigen drift av NA. I tillegg kan antigene analyse av NAs fra svin eller fugleinfluensa virus gi viktig informasjon i å bestemme pandemisk potensial for nye stammer.
The authors have nothing to disclose.
This project was funded by intramural PanFlu funds from the Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Plasmids used to prepare reassortant viruses were kindly provided by Robert Webster, St Jude Children’s Research Hosptial, Memphis, TN. We are indebted to Ewan Plant and Haruhiko Murata for critical review of the manuscript.
coating buffer | KPL | 50-84-01 |
fetuin | Sigma | F3385 |
5X MES, pH 6.5 | KD-Medical | PBS-0134 |
CaCl2 | Sigma | C7902 |
30% BSA | Sigma | A8327 |
Tween 20 | Sigma | P1379 |
Lectin PNA-HRPO | Sigma | L7759 |
PBS-T | Sigma | P3563-10PAK |
o-Phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 |
phosphate-citrate buffer | Sigma | P4922 |
Sulfuric acid | Sigma | 258105 |
96-well Maxisorp plates | NUNC | 439454 |
96-well round bottom well plates | NUNC | 267245 |
Plate sealers | Thermo Scientific | 14-245-192B |
chicken eggs | Charles River Laboratories | 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs |
multichannel pipette | Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf | 8 or 12 channel manual pipettem 50-250 µl volume |
Pipette tips | Depends on pipettor brand | Depends on pipettor brand |
Plate reader, with 490 nm filter | Perkin Elmer | Victor V |
water bath set to 37 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
water bath set to 56 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
refrigerator set to 4 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
incubator set to 37 °C | Variety of suppliers | Variety of models |