le<em> Drosophila</em> Imaginal Tumor Disc Modèle: Visualisation et quantification de l'expression génique et de tumeurs invasives utilisant Mosaïques génétique

Summary

Ce protocole montre comment générer des tumeurs clonales marquée par fluorescence, génétiquement définis dans l'œil de Drosophila / disques imaginaux antennaires (EAD). Il décrit comment disséquer l'EAD et le cerveau à partir du troisième stade larvaire et comment les traiter pour visualiser et quantifier les changements d'expression des gènes et l'invasivité des tumeurs.

Abstract

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

Introduction

Le cancer représente l'un des groupes les plus génétiquement hétérogène de maladies, dont l'incidence et la mortalité est considérablement augmenter, en particulier chez les personnes âgées dans le monde entier. Le cancer provient clonale d'une cellule tumorale initiatrice qui échappe des mécanismes suppresseurs de tumeur inhérente et se divise hors de contrôle. L'accumulation progressive de lésions génétiques qui favorisent la collaboration la croissance, la prolifération et la motilité tout en inhibant la mort et la différenciation transforme la surcroissance bénigne initiale dans une tumeur très maligne, métastatique et mortelle. Il est devenu évident qu'en plus des altérations génétiques, la progression de la tumeur nécessite des changements dans le stroma environnant et la diaphonie entre les types de cellules tumorales et de multiples (par exemple, des fibroblastes et des cellules immunitaires endothéliales) dans son micro – environnement. Comprendre les principes moléculaires sous-jacents, y compris la transformation maligne interactions tumeur-stroma est d'une grande importance pour le développement de prévention et le dépistage précoce des stratégies, ainsi que des traitements nouveaux et efficaces pour lutter contre les métastases du cancer et de la résistance aux médicaments.

La mouche des fruits Drosophila melanogaster est devenu un système attrayant pour la recherche sur le cancer ^1-4 en raison de son temps de génération rapide, remarquable conservation des noeuds entre les mouches et les humains, la redondance génétique limitée et la richesse des outils génétiques avancées qui facilitent la manipulation de presque tout gène dans la signalisation d'une manière temporaire et dans l'espace restreint. Les tumeurs génétiquement définies de malignité variable peuvent être conçus de façon reproductible chez la drosophile en introduisant des mutations perte et intensité forte de fonction dans un sous – ensemble de progéniteurs dans un tissu de type sauvage par ailleurs en utilisant la technique de ⁵ marcm. L'outil de marcm combine FLP / FRT (FLP recombinase / FLP Reconnaissance cible) médiée recombinaison mitotique ⁶ avec FLP-out ⁷ et Gal4 / UAS (Upstream Activation Séquence) gène ⁸ cibleLes systèmes d'expression ^9. Avec cette méthode, l'expression d'un transgène à base UAS, y compris oncogène ou des ADNc de protéines fluorescentes ou répétitions d'ADN inversées pour le silençage génique ARNdb-induite, sera limitée à un clone de cellules qui ont perdu un locus génétique spécifique et un répresseur Gal4 due à la recombinaison (figure 1A). Patches clonales marqués avec fluorescente verte (GFP) ou des protéines fluorescentes rouges (par exemple, RFP, DsRed, mCherry) peut facilement être suivis tout au long du développement, isolé et analysé. Surtout, leur comportement peut être comparé directement au tissu adjacent sauvage de type. Ainsi, des questions pertinentes à la cellule des effets autonomes et non autonomes de lésions génétiques peuvent être facilement étudiées. Comme pour les mammifères, seuls clones dans lesquels de multiples lésions oncogéniques sont combinés deviennent malignes chez la drosophile et récapitulent caractéristiques clés du cancer chez les mammifères. Ils overproliferate, échapper à l'apoptose, provoquer l'inflammation, devenir immortel et Invasive, finalement tuer l'hôte ^10-17.

Ici, nous décrivons un protocole pour générer des tumeurs clonales génétiquement définies dans le tissu oculaire / antennaire et le cerveau des larves de drosophile en utilisant la technique de marcm. La méthode repose sur un testeur de stock marcm qui exprime la levure FLP recombinase sous le contrôle de l'amplificateur eyeless (eyFLP) ^18,19. De cette manière, les clones GFP marquées sont générées à la fois dans l' épithélium cylindrique peripodial et de l'EAD et le neuroépithélium du cerveau à travers les stades embryonnaire et larvaire (figure 1A, B et référence ^20). Les clones peuvent être facilement suivis jusqu'à l'âge adulte que l'EAD se développe dans l'œil adulte, l'antenne et la tête tandis que la capsule neuroepithelium donne lieu à des neuroblastes qui produisent des neurones du lobe optique différenciés.

Pour faciliter une caractérisation moléculaire, fonctionnelle et phénotypique du tissu mosaïque, nous describe un protocole pour la dissection de l'EAD et le cerveau à partir du troisième stade larvaire et décrire la façon de les traiter pour les trois applications différentes: (i) la détection des reporters fluorescents transgéniques et immunomarquage, (ii) la quantification de l'invasivité de la tumeur et (iii) l'analyse des modifie l' expression du gène en utilisant une PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) ou d' un ARNm de séquençage à haut débit (ARNm-seq) (figure 1C).

Le protocole d'immunocoloration peut être utilisé pour visualiser toute protéine d'intérêt avec un anticorps spécifique. Transgenic reporters de transcription fluorescentes fournissent des informations spatiotemporelle pratique et précise sur l'activité d'une voie de signalisation particulière. journalistes spécifiques Cell-lignage, d'autre part, tenir compte des changements qualitatifs et quantitatifs dans les populations de cellules dans le tissu mosaïque et parmi les tumeurs de génotypes distincts. Quantification de comportement invasif facilite la comparaison de malignité de la tumeur entre le génotypes. Enfin, le protocole décrivant la collecte et le traitement de l'EAD mosaïque pour l'isolement de l'ARN est adapté pour les applications en aval petite et à grande échelle tels que la transcription inverse suivie par qRT-PCR et pangénomique ARNm-seq, respectivement. Les données qualitatives et quantitatives obtenues à partir de ces essais fournissent de nouveaux aperçus sur le comportement social des tumeurs clonales. De plus, ils produisent une base solide pour des études fonctionnelles sur le rôle des gènes individuels, des réseaux génétiques et microenvironnement de la tumeur dans les différentes étapes et les aspects de la tumorigenèse.

Protocol

NOTE: Ce travail utilise le eyFLP1; acte> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, baignoire-GAL80 marcm 82B ligne verte testeur 11. Traversant les marcm 82B verts testeur vierges aux mâles de souches telles que w; UAS-a; UAS-b ARNi, FRT82B c mut génotype donnera une descendance dans laquelle la recombinaison mitotique se produira entre le bras droit de la 3 ème chromosomes homologues. De cette manière, les clones mutants homozygotes pour le gène c situé distal…

Representative Results

Pour démontrer le potentiel de la technique eyFLP-marcm pour générer des correctifs de GFP marquée de génotypes définis dans la drosophile EAD, trois types de clones ont été induits: (1) le contrôle GFP exprimant seulement, (2) les tumeurs malignes exprimant une forme oncogénique de la petite G-protéine Ras (Ras V12) dans un contexte de perte homozygote d'un gribouillis de gène suppresseur de tumeur (Scrib 1), et (3) surcro…

Discussion

Les techniques pour générer des mosaïques génétiques chez la drosophile sont parmi les outils les plus sophistiqués pour l' analyse et la manipulation de la fonction des gènes ^33. Le système eyFLP-marcm a prouvé puissant et robuste , car elle permet l'induction de marqués visuellement, clones génétiquement définis d'une manière spatialement restreinte, à savoir, dans les tissus où l'activateur eyeless est actif ^9,18. Ceci est particulièrem…

Materials

Agar	Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany	00262-0500	Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85°C.
Corn syrup	Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany	01939
Propionic acid	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6026.1
Cornmeal	ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany	4010155063948
Malt extract	CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany	728985
Soy flour	Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany	1000246441010
Yeast	Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany	210099K
Methyl-4-benzoate/ Nipagin	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	H5501	Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH
Drosophila fly food vials	Kisker Biotech, Steinfurt, Germany	789008
Vial plugs	K-TK e.K., Retzstadt, Germany	1002
Drosophila fly food bottles	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	960177
Bottle plugs	K-TK e.K., Retzstadt, Germany	1002 S
Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	81381	Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50°C and centrifuge 20 min at 5000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20°C.
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	D2522
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	9002-93-1
Phosphate-buffered saline/ PBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O
PBST			0.1% Triton X-100 in PBS
Paraformaldehyde/ PFA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	158127	4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10X PBS and adjust the pH to 7.4 with 1M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20°C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes)
Bovine Serum Albumin/ BSA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	A3059	Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST
4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6335	DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4°C. Used in dilution 1:1000 in PBST.
Alexa Flour 546 Phalloidin	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	A22283	Used in dilution 1:500 in PBST.
Mouse anti-H2 antibody	Kurucz et al., 2003		Used in dilution 1:500 in blocking solution
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK	715-175-151	Used in dilution 1:500 in blocking solution
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11295-10
Glass embryo dish (30 mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	E90
Tungsten needles	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	10130-20
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	26018-17
Microscope slides	VWR, Darmstadt, Germany	631-1553
Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser)	VWR, Darmstadt, Germany	631-1336
Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	1076371
Kimtech Science Precision Wipes	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	06-677-70
Dissecting stereomicroscope	Olympus, Hamburg, Germany	SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan)
Fluorescent stereomicroscope	Olympus, Hamburg, Germany	SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera	Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11.
Confocal microscope	Olympus, Hamburg, Germany	FV1000	Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15mW) and Red Laser diode 635 (20mW). Software: Fluoview 2.1c Software
Drosophila cooled incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany	Sanyo MIR553
Squirt bottle	VWR, Darmstadt, Germany	215-8105
BD Clay Adams Nutator Mixer	VWR, Darmstadt, Germany	15172-203
ELMI Digital Rocking Shaker	VWR, Darmstadt, Germany	DRS-12
5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent	VWR, Darmstadt, Germany	2302700	The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents e.g. TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596).
Diethyl pyrocarbonate/ DEPC	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	D5758	Dilute DEPC 1:1000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave.
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany	15593-031
Chloroform	Merck, Darmstadt, Germany	102445
TURBO DNase (2 U/µl)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	AM2238
Invitrogen UltraPure Glycogen	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany	10-814-010
Sodium acetate trihydrate	VWR, Darmstadt, Germany	27652.232	Prepare a 3M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2
2-Propanol	Merck, Darmstadt, Germany	109634
Ethanol	Merck, Darmstadt, Germany	100983	Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O.
UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	ND-8000
Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	5417R
Experion RNA StdSens Analysis Kit	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	7007103
Experion Automated Electrophoresis Station	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	7007010
SuperScript III Reverse Transcriptase	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	18080044
Oligo d(T) Primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H20 and store at -20°C
dNTP Mixture	Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France	4030	Store aliquots of 25 µl at -20°C
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	1855195
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	170-8882
Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	HSP9601
Microseal 'B' Film	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	MSB1001
rp49 Forward primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' TCCTACCAGCTTCAAGATGAC 3'
rp49 Reverse primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' CACGTTGTGCACCAGGAACT 3'
mmp1 Forward primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' AGGGCGACAAGTACTACAAGCTGA 3'
mmp1 Reverse primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' ACGTCTTGCCGTTCTTGTAGGTGA 3'