Anvendelser af pHluorin Kvantitative, Kinetic og High-throughput Analyse af Endocytose i Spirende gær

Summary

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Abstract

Grøn fluorescerende protein (GFP) og dens varianter er meget udbredt værktøj til at studere protein lokalisering og dynamik begivenheder såsom cytoskeletal remodellering og vesikulær handel med levende celler. Kvantitative metoder der anvender kimære GFP-fusioner er blevet udviklet til mange anvendelser; dog GFP er noget resistente over for proteolyse, således sin fluorescens fortsætter i lysosomet / vacuolen, som kan hæmme kvantificering af fragt handel i endocytiske proces. En alternativ fremgangsmåde til kvantificering endocytose og post-endocytiske trafficking begivenheder gør brug af superecliptic pHluorin, en pH-følsom variant af GFP, der er standset i sure miljøer. Kimære fusion af pHluorin til cytoplasmatiske hale af transmembrane fragt proteiner resulterer i en afdæmpning af fluorescens ved inkorporering af lasten i multivesikulære organer (MVBs) og levering til lysosomer / vacuole lumen. Således quenching af vakuolær fluorescens letter kvantifikation af endocytose og tidlige begivenheder i endocytiske proces. Dette papir beskriver fremgangsmåder, der anvender pHluorin-mærkede ladninger til kvantificering af endocytose via fluorescensmikroskopi samt populationsbaserede assays under anvendelse af flowcytometri.

Introduction

Vesikulær handel spiller en vigtig rolle i at opretholde organel identitet og funktion i eukaryote celler, og er en vigtig mekanisme til at regulere protein og membran sammensætning af individuelle cellulære rum. Ved plasmamembranen, fusion af exocytiske vesikler leverer nye proteiner og membraner til overfladen af ​​cellen, mens vesikler genereres via endocytose fjerne membran og proteiner fra overfladen til efterfølgende genbrug eller målretning til lysosomet. Således endocytose er vigtig for optagelse af næringsstoffer og for svar på det ekstracellulære miljø. Exocytose og endocytose er afbalanceret til at regulere plasmamembranen areal, og at tillade omsætning af beskadigede proteiner.

Studier i gær og mammale celler har identificeret et stort antal proteiner involveret i endocytose, samt flere endocytiske veje, der fremmer internalisering af specifikke ladninger, eller at reagere på en række enmæssige forhold. Den bedst undersøgte pathway er clathrin endocytose (CME), hvori clathrin og cytosoliske accessoriske proteiner samles til en frakke struktur til at stabilisere den spirende endocytiske vesikel. Forsøg i den spirende gær Saccharomyces cerevisiae har givet vigtige indsigter i dynamik og rækkefølge af rekruttering til mange endocytiske proteiner ^1-3. Især er CME maskiner højt konserveret gennem evolutionen, således at størstedelen af ​​CME-relaterede proteiner i gær har humane ortologer; således, knopskydende gær har været et vigtigt redskab til at forstå mekanismerne i endocytose, som er konserverede i højere eukaryoter. For eksempel, undersøgelser under anvendelse af knopskydende gær fastslået, at dannelse og modning af CME strukturer (benævnt kortikale actin patches i gær) involverer den sekventielle rekruttering af mange proteiner, der begynder med clathrin og fragt-bindende adapter proteiner, efterfulgt af ansættelse af yderligere endocytiske tilbehør proteiner,aktivering af ARP2 / 3-medieret actinpolymerisation, og rekruttering af proteiner involveret i vesikel opdeling ^1,2. Rekruttering af CME maskiner proteiner til cortical actin patches er en meget ordnet og stereotype proces, og den præcise rækkefølge af rekruttering til mange proteiner er blevet etableret med hensyn til andre dele af CME maskiner. Vigtigere, de seneste undersøgelser har bekræftet en lignende rækkefølge af rekruttering til CME proteiner på clathrin-belagte gruber i pattedyrceller ^4.

Foruden CME, mange celletyper have et eller flere clathrin-uafhængig endocytiske (CIE) baner der er afhængige af alternative mekanismer til fremme vesikeldannelse og internalisering fra plasmamembranen ^5-7. I gær vi for nylig identificeret en CIE sti, der udnytter den lille GTPase Rho1 og dets aktivering guanin nukleotid udveksling faktor (GEF), ROM1 ^8,9. Rho1 aktiverer formin Bni1 at fremme actinpolymerisation ¹0,11, hvilket er påkrævet for denne form for clathrin-uafhængig endocytose i gær ^12. Desuden α-arrestin-familien af proteiner rekruttere ubiquitin ligase Rsp5 at fremme fragt ubiquitinering og efterfølgende internalisering gennem CME ^13-17, og også fremme fragt internalisering via CIE-vejen, eventuelt gennem direkte interaktion med proteiner involveret i CIE ^18. En række af CIE pathways også eksistere i mammale celler, herunder clathrin-uafhængig og fagocytiske veje, der er afhængige af Rho1 ortholog, RhoA ^9,19. Rolle RhoA i pattedyr CIE er dårligt forstået; dermed kan studier i spirende gær give yderligere mekanistiske indsigt, der gælder for pattedyr CIE.

Nøjagtig kvantificering af endocytiske begivenheder kan give vigtige oplysninger om roller specifikke proteiner i reguleringen endocytose, og kan afsløre effekten af ​​mutationer på fragt internalisering eller Progression gennem endocytiske proces. Til dette formål kan biokemiske metoder anvendes til at overvåge ligand optagelse eller at måle nedbrydningshastigheder af endocytiske lastproteiner. I levende celler, fusion af grønt fluorescerende protein (GFP) og dens varianter til laster af interesse giver mulighed for direkte visualisering af godstransport. Imidlertid GFP-mærkede ladninger er af begrænset anvendelse til kvantificering af endocytose fordi GFP er resistente over for nedbrydning i lysosomer (eller vacuolen i gær). Endvidere GFP-fluorescens er kun delvis følsom over for ændringer i pH, og fortsat kan spores inden vacuolen lumen ^20,21. Følgelig fluorescens af GFP tag fortsætter i vacuolen længe efter resten af ​​lasten er nedbrudt, og helcelle-baseret kvantificering af lasten intensitet kan være upræcis pga langvarig GFP-fluorescens i vacuolen.

For at overvinde ulemperne ved vakuolær GFP-fluorescens, vi tidligere gjort brug af superecliptic pHluorin, en pH-følsom variant af GFP, der fluorescerer lyst ved neutral pH, men mister fluorescens i sure miljøer såsom hulrummet i vacuolen / lysosomet ^20,22,23. Placering af et pHluorin tag på den cytoplasmatiske hale af endocytiske laster tillader visualisering af laster på plasmamembranen og på tidlige endosomer, hvor pHluorin tag forbliver eksponeret for cytoplasmaet (figur 1A). Som tidlige endosomer modne, den endosomale sortering komplekse kræves for transport (ESCRT) maskiner pakker overfladeaktive lokaliserede ladninger i vesikler, der opløbet ind i lumen af endosomet, genererer multivesikulære organer (MVBs) ^24. For ladninger, der er blevet indarbejdet i de interne MVB vesikler, den pHluorin tag vender mod vesikel lumen. Interne MVB vesikler syrnet; således, pHluorin-mærkede last mister fluorescens på tidlige endosomer som de modnes til MVBs ^20. Efterfølgende fusion af MVB med vacuolen leverer MVB luminale indholdfor nedbrydning, forbliver og pHluorin tags standset i det sure miljø i vacuolen lumen.

Dette papir giver detaljerede beskrivelser af kvantitative endocytiske assays ved anvendelse af ladninger med cytoplasmatiske pHluorin tags i gær. Stammer, der udtrykker pHluorin-mærkede ladninger kan anvendes i kinetiske og / eller endpoint assays, afhængigt af egenskaberne og ulovlig adfærd den transporterede last. Desuden er nogle pHluorin-mærkede laster kan underkastes high-throughput analysemetoder, herunder flowcytometri. Vigtigere er det, pHluorin tag er et alsidigt værktøj til at studere endocytiske begivenheder i levende celler, tillader kvantificering af endocytose og sammenligning af endocytiske funktion i vildtype- og mutantstammer.

Protocol

1. Løsninger og Medier Forbered følgende bestande, Medier og Plader: Til fremstilling 10x YNB, opløses 67 g gærnitrogenbase mangler aminosyrerne i 1 I vand. Der steriliseres ved filtrering gennem et 0,22 um nitrocellulosefilter. Forbered YNB medium ved hjælp 1x YNB (fra 10x lager) med 2% dextrose (fra en steril 50% w / v lager), og blandingen 1x aminosyre / næringsstof (fra 100x lager, se trin 1.1.4). For plasmid udvælgelse, udelade individuelle aminosyrer eller næringsstoffer efter…

Representative Results

Steady-state lokalisering og kvantificering af konstitutivt internaliseret endocytiske last protein Ste3 For at demonstrere at pHluorin-mærkede ladninger kan anvendes til kvantificering af endocytose i levende celler, lokalisering af kimært GFP og pHluorin fusioner med det cytoplasmiske C-terminale hale af Ste3, a-faktor pheromon receptoren i gær, blev sammenlignet. Ste3 er en G-protein-koblede receptorer (…

Discussion

Anvendelser af pHluorin til kvantificering af endocytiske begivenheder i gærceller gør brug af transmembrane laster, hvor det fluorescerende mærke er fusioneret til den cytoplasmiske hale af proteinet (figur 1A). For analyserne beskrevet her, laster er lyst fluorescerende når pHluorin tag udsættes for neutrale miljøer, men bliver standset, når pHluorin tag støder sure betingelser. Således er en pHluorin-mærket endocytisk last let påvises ved cytoplasmatiske side af plasmamembranen og på tidl…

Materials

Adenine	Sigma	A8626-25G	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
Bacto-agar	Fisher	BP1423-2	Use for preparation of plate media
BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids)	BD	291920	Use for preparation of liquid and plate media
Concanavalin A	Sigma	C5275-5MG	Use for coating of chamber slides
Dextrose	Fisher	BP350-1	Use for preparation of liquid and plate media
L-Histidine	Fisher	BP382-100	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Leucine	Acros	125121000	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Lysine	Fisher	BP386-100	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Methionine	Fisher	BP388-100	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Tryptophan	Fisher	BP395-100	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Tyrosine	Acros	140641000	Use for preparation of amino acid mixture
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well)	Thermo Scientific	155411	Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization
Uracil	Sigma	U0750-100G	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
Axiovert 200 inverted microscope	Carl Zeiss	Custom Build
100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens	Carl Zeiss		Objective should be 100X, 1.4NA or higher
Sensicam	Cooke Corporation		Camera should have 12-bit or higher dynamic range
X-Cite 120PC Q Illumination Source	Excelitas Technologies
Slidebook 5 software	Intelligent Imaging Innovations
ImageJ software	National Institutes of Health		http://imagej.nih.gov/ij/