Aplicações de pHluorin para Quantitative, Kinetic e de alta capacidade: Análise de endocitose em brotamento Yeast

Summary

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Abstract

A proteína fluorescente verde (GFP) e suas variantes são ferramentas amplamente utilizado para estudar a localização de proteínas e na dinâmica de eventos, tais como a remodelação do citoesqueleto e tráfico vesicular em células vivas. Metodologias quantitativas utilizando fusões quiméricas GFP foram desenvolvidos para muitas aplicações; No entanto, a GFP é um tanto resistente à proteólise, assim, a sua fluorescência persistir no lisossoma / vacúolo, o que pode dificultar a quantificação de tráfico de carga na via endocítica. Um método alternativo para a quantificação de endocitose e pós-endocíticas eventos de tráfico faz uso de superecliptic pHluorin, uma variante sensível ao pH da GFP que é extinta em ambientes ácidos. fusão quimérica de pHluorin à cauda citoplasmática de transmembrana de carga proteínas resulta em um amortecimento de fluorescência após a incorporação da carga em corpos multivesiculares (MVBs) e entrega para o lúmen lisossoma / vacúolo. Assim, extinção da fluorescência vacuolar facilita quantificatião de endocitose e eventos precoces na via endocítica. Este artigo descreve métodos que utilizam cargas pHluorin-marcadas para quantificação de endocitose via microscopia de fluorescência, bem como ensaios de base populacional utilizando citometria de fluxo.

Introduction

tráfico vesicular desempenha um papel importante na manutenção e função identidade organelo em células eucariotas, e é um mecanismo fundamental para a regulação da composição de proteína e membrana de compartimentos celulares individuais. Na membrana plasmática, a fusão de vesículas exocíticos proporciona novas proteínas e membranas à superfície da célula, ao passo que as vesículas gerados através de endocitose remover membrana e proteínas a partir da superfície para a reciclagem ou o direccionamento para o lisossoma subsequente. Assim, é importante para a endocitose a absorção de nutrientes e para as respostas para o ambiente extracelular. A exocitose e endocitose são equilibradas para regular a área de superfície da membrana de plasma, e para permitir a rotatividade de proteínas danificadas.

Os estudos em células de levedura e de mamífero ter identificado um grande número de proteínas envolvidos em endocitose, bem como a múltiplas vias de endocitose que promovem a internalização de cargas específicas ou que agem em resposta a uma variedade de encondições tações. A via mais bem estudado é endocitose mediada por clatrina (CME), em que a proteína clatrina e acessórios citosólico em montar uma estrutura de revestimento para estabilizar a vesícula endocítica nascente. Experiências no brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae produziram informações importantes sobre a dinâmica ea ordem de recrutamento para muitas proteínas de endocitose ^1-3. Notavelmente, a maquinaria CME é altamente conservada ao longo da evolução de tal modo que a maioria das proteínas relacionadas com o CME em levedura tem ortólogos humanos; Assim, a brotação levedura tem sido uma ferramenta importante para a compreensão dos mecanismos de endocitose que são conservados em eucariotas superiores. Por exemplo, estudos utilizando levedura de germinação determinado que a formação e maturação de estruturas CME (referidas manchas de actina como corticais em levedura) envolve o recrutamento sequencial de muitas proteínas, começando com clatrina e proteínas adaptadoras de ligação de carga, seguido de recrutamento de acessório endocítica adicional proteínas,activação da polimerização de actina Arp2 / 3-mediada, e recrutamento de proteínas envolvidas em ^1,2 vesícula cisão. Recrutamento de proteínas para máquinas CME cortical manchas de actina é um processo altamente ordenada e estereotipada, e a ordem exacta do recrutamento para muitas proteínas foi estabelecida com respeito a outros componentes da maquinaria de CME. Importante, estudos mais recentes confirmaram uma ordem semelhante de recrutamento de proteínas CME em depressões revestidas de ^clatrina-4 em células de mamífero.

Além CME, muitos tipos de células possuem um ou mais endocítica (CIE) vias independentes de clatrina que se baseiam em mecanismos alternativos para promover a formação de vesículas e internalização da membrana do plasma ^{de 5-7.} Em leveduras, que recentemente identificaram um caminho CIE que utiliza a pequena GTPase Rho1 e sua ativação guanina fator de troca de nucleotídeos (GEF), Rom1 ^8,9. Rho1 activa o formin Bni1 para promover a polimerização da actina ¹0,11, o que é necessário para esta forma de endocitose independente de clatrina em levedura ^12. Além disso, a família α-arrestina de proteínas recrutar o ubiquitina ligase Rsp5 para promover ubiquitination carga e internalização posterior pelo CME ^13-17, e também promover a internalização de carga pela via CIE, possivelmente através de interacção directa com proteínas envolvidas no CIE ^18. Uma variedade de vias CIE também existe nas células dos mamíferos, incluindo as vias independentes de clatrina e fagocíticas que dependem do ortólogo Rho1, RhoA ^9,19. O papel de RhoA em CIE de mamífero é mal compreendida; Assim, os estudos em levedura de brotamento pode fornecer insights mecanicistas adicionais que são aplicáveis ​​a CIE mamíferos.

quantificação precisa dos acontecimentos de endocitose pode fornecer informações importantes sobre os papéis de proteínas específicas na regulação endocitose, e pode revelar os efeitos das mutações no internalização carga ou progressioN através da via endocítica. Para este efeito, métodos bioquímicos podem ser utilizados para monitorar a absorção do ligando ou para medir as taxas de degradação de proteínas de carga de endocitose. Em células vivas, a fusão da proteína verde fluorescente (GFP) e suas variantes para cargas de interesse permite a visualização direta de transporte de carga. No entanto, cargas GFP são de uso limitado para a quantificação de endocitose porque GFP é resistente à degradação no lisossoma (ou vacúolo em levedura). Além disso, a GFP fluorescente é apenas parcialmente sensível a mudanças no pH, e permanece detectável dentro do vacúolo lúmen ^20,21. Consequentemente, a fluorescência do marcador GFP persistir no vacúolo longo após o restante da carga foi degradada, e quantificação baseado em células inteiras de intensidade de carga podem ser imprecisas devido à fluorescência da GFP longo prazo no vacúolo.

A fim de ultrapassar os inconvenientes da fluorescência de GFP vacuolar, que anteriormente feito uso de pH supereclipticluorin, uma variante sensível ao pH da GFP que fluoresce intensamente a pH neutro, mas perde fluorescência em ambientes ácidos, tais como o lúmen do vacúolo / lisossomo ^20,22,23. Colocação de uma etiqueta pHluorin na cauda citoplasmática de cargas de endocitose permite a visualização das cargas na membrana plasmática e em endossomas precoces, onde a etiqueta pHluorin permanece exposta ao citoplasma (Figura 1A). Já endossomos maduros, o complexo endossomal triagem necessária para embalagens de transporte (ESCRT) máquinas cargas localizadas de superfície em vesículas que brotam no lúmen do endossomo, gerando corpos multivesiculares (MVBs) ^24. Para cargas que foram incorporados em vesículas internas MVB, a tag pHluorin faces para o lúmen das vesículas. MVB vesículas internas são acidificada; Assim, cargas pHluorin-tag perder sua fluorescência no início endossomas à medida que amadurecem em MVBs ^20. fusão subsequente da MVB com o vacúolo oferece o conteúdo MVB luminaispara a degradação, tags e pHluorin permanecem extinta no ambiente ácido do lúmen do vacúolo.

Este artigo fornece descrições detalhadas dos ensaios de endocitose quantitativos usando cargas com marcas pHluorin citoplasmáticos em levedura. As estirpes que expressam cargas pHluorin-tag podem ser utilizados em ensaios cinéticos e / ou ponto de extremidade, em função das propriedades e o comportamento de tráfico da carga específica. Além disso, algumas cargas pHluorin-tag são passíveis de métodos de análise de alto rendimento, incluindo citometria de fluxo. Importante, a tag pHluorin é um instrumento versátil para estudar eventos de endocitose nas células vivas, permitindo a quantificação de endocitose e comparação da função endocítica no tipo selvagem e estirpes mutantes.

Protocol

1. Soluções e mídia Prepare os estoques A seguir, Mídia e Placas: Para preparar 10x YNB, dissolve-se 67 g de base azotada de levedura sem aminoácidos, em 1 L de água. Esterilizar por filtração através de um filtro de nitrocelulose de 0,22 um. Prepare meio YNB usando 1x YNB (a partir de 10x estoque) com dextrose% 2 (de um estéril 50% w / v estoque) e mistura 1x aminoácido / nutriente (de 100x estoque, consulte o passo 1.1.4). Para a selecção do plasmídeo, omitir aminoácidos in…

Representative Results

Localização de estado estacionário e quantificação da proteína carga endocítica constitutivamente internalizado Ste3 Para demonstrar que as cargas pHluorin-tag pode ser utilizada para a quantificação de endocitose em células vivas, a localização de GFP quimérico e fusões pHluorin com a cauda citoplasmática de terminal-C de Ste3, o receptor de feromonas do factor A em levedura, foram comparados. …

Discussion

Aplicações de pHluorin para quantificação de eventos de endocitose em células de levedura faz uso de cargas transmembranares em que o marcador fluorescente está fundido com a cauda citoplasmática da proteína (Figura 1A). Para os ensaios aqui descritos, as cargas são fluorescentes brilhantemente quando a etiqueta pHluorin é exposta a ambientes neutros, mas tornar-se temperada, quando a etiqueta encontra pHluorin condições ácidas. Assim, uma carga endocítica pHluorin-etiquetado é facilmente…

Materials

Adenine	Sigma	A8626-25G	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
Bacto-agar	Fisher	BP1423-2	Use for preparation of plate media
BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids)	BD	291920	Use for preparation of liquid and plate media
Concanavalin A	Sigma	C5275-5MG	Use for coating of chamber slides
Dextrose	Fisher	BP350-1	Use for preparation of liquid and plate media
L-Histidine	Fisher	BP382-100	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Leucine	Acros	125121000	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Lysine	Fisher	BP386-100	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Methionine	Fisher	BP388-100	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Tryptophan	Fisher	BP395-100	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Tyrosine	Acros	140641000	Use for preparation of amino acid mixture
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well)	Thermo Scientific	155411	Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization
Uracil	Sigma	U0750-100G	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
Axiovert 200 inverted microscope	Carl Zeiss	Custom Build
100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens	Carl Zeiss		Objective should be 100X, 1.4NA or higher
Sensicam	Cooke Corporation		Camera should have 12-bit or higher dynamic range
X-Cite 120PC Q Illumination Source	Excelitas Technologies
Slidebook 5 software	Intelligent Imaging Innovations
ImageJ software	National Institutes of Health		http://imagej.nih.gov/ij/