Применение pHluorin для количественного, Kinetic и высокой пропускной способностью анализа эндоцитоза у почкующихся дрожжей
Summary
Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.
Abstract
Зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его варианты широко используются инструменты для изучения локализации белка и динамики событий, таких как цитоскелета ремоделирования и везикулярного торговли в живых клетках. Количественные методики с использованием химерных GFP слитых были разработаны для многих приложений; однако, GFP несколько устойчив к протеолизу, таким образом, его флуоресценция сохраняется в лизосом / вакуоли, которые могут препятствовать квантификацию торговли грузов в эндоцитотического пути. Альтернативный метод количественной оценки событий торговли людьми эндоцитоза и пост-эндоцитических использует superecliptic pHluorin, рН-чувствительный вариант GFP, который гасится в кислой среде. Химерический слияние pHluorin к цитоплазматическим хвостом трансмембранный грузовых белков приводит в демпфирование флуоресценции при включении груза в мультивезикулярных тел (MVBs) и доставки в лизосомы / вакуоли просвет. Таким образом, тушение флуоресценции вакуолярной облегчает quantifiкатион эндоцитоза и ранних событий в эндоцитотического пути. В данной статье описаны методы, использующие pHluorin-маркированные грузы для количественной оценки эндоцитоза с помощью флуоресцентной микроскопии, а также анализы населения на основе с использованием проточной цитометрии.
Introduction
Везикулярный торговля играет важную роль в поддержании идентичности органелл и функцию в эукариотических клетках, и является ключевым механизмом для регулирования белков и мембран состава отдельных клеточных отсеков. На плазматической мембране, слияние exocytic везикул содержит новые белки и мембраны на поверхности клетки, в то время как пузырьки, генерируемые посредством эндоцитоза удалить мембрану и белки с поверхности для последующей переработки или нацеливание в лизосомы. Таким образом, эндоцитоз имеет важное значение для поглощения питательных веществ и для ответов на внеклеточную среду. Экзоцитоз и эндоцитоз сбалансированы регулировать площадь поверхности плазматической мембраны, и обеспечить оборот поврежденных белков.
Исследования, проведенные в дрожжах и клетках млекопитающих выявили большое количество белков, участвующих в эндоцитоза, а также несколько эндоцитических путей, которые способствуют интернализации конкретных грузов или этот акт в ответ на различные анжающей среды условия. Наиболее изученный путь является клатрин-опосредованный эндоцитоз (CME), в котором клатрина и цитозольная вспомогательные белки собираются в структуру покрытия, чтобы стабилизировать зарождающееся эндоцитических пузырек. Эксперименты в почкующихся дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE дали глубокие знания о динамике и порядок набора для многих белков эндоцитических 1-3. Следует отметить, что техника СМЕ высоко консервативен в ходе эволюции таким образом, что большинство СМЕ-родственных белков в дрожжах имеют человеческие ортологи; Таким образом, почкующихся дрожжей стала важным инструментом для понимания механизмов эндоцитоза, которые являются консервативными в высших эукариот. Например, исследования с использованием многообещающий дрожжей определяют, что формирование и созревание CME структур (называемых корковых пластырей актина у дрожжей) включает в себя последовательный набор многих белков, начиная с клатрина и грузовыми-связывающим адаптерных белков, а затем набор дополнительного эндоцитотического принадлежности белки,активация Arp2 / 3-опосредованной полимеризации актина, и набор белков , участвующих в пузырек 1,2 разрыва. Набор машинных белков CME кортикальных актиновых заплатки является весьма упорядоченные и стереотипное процесс, и точный порядок набора для многих белков было установлено по отношению к другим компонентам оборудования CME. Важно отметить, что недавние исследования подтвердили , аналогичный порядок набора для CME белков на клатриновых ямах в клетках млекопитающих 4.
В дополнение к КВМ, многие типы клеток , обладающие одной или несколькими клатриновых-независимый эндоцитотический (CIE) пути , которые полагаются на альтернативные механизмы для содействия формированию везикул и интернализации из плазматической мембраны 5-7. У дрожжей, недавно мы определили CIE путь , который использует небольшой GTPase Rho1 и его активации гуанин фактор нуклеотид обмена (ГЭФ), Rom1 8,9. Rho1 активирует Formin Bni1 для содействия актина полимеризации 10,11, который необходим для этой формы клатрин-независимого эндоцитоза у дрожжей 12. Кроме того, α-arrestin семейство белков Набирать убиквитинлигаза Rsp5 для содействия убиквитинирование грузов и последующей интернализации через НМО 13-17, а также содействовать интернализации грузов через МКО пути, возможно , за счет прямого взаимодействия с белками , участвующими в CIE 18. Разнообразие путей CIE существуют также в клетках млекопитающих, в том числе клатриновых независимый и фагоцитирующих путей , которые полагаются на ортолога Rho1, RhoA 9,19. Роль RhoA в CIE млекопитающих изучена слабо; Таким образом, исследования в почкующихся дрожжей может обеспечить дополнительные механистические идеи, которые применимы к CIE млекопитающих.
Точная количественная оценка эндоцитических событий может предоставить важную информацию о роли специфических белков в регуляции эндоцитоза, и может выявить влияние мутаций на грузовом интернализации или Progressioп через эндоцитотического пути. Для этой цели, биохимические методы могут быть использованы для мониторинга поглощения лиганда или для измерения скорости деградации эндоцитических грузовых белков. В живых клетках, слияние зеленого флуоресцентного белка (GFP) и его вариантов для грузов, представляющих интерес позволяет осуществлять прямую визуализацию грузового транспорта. Тем не менее, GFP-меченый грузов, имеют ограниченное применение для количественной оценки эндоцитоза, так как GFP, устойчив к деградации в лизосомах (или вакуоли в дрожжах). Кроме того, GFP флуоресценции только частично чувствительна к изменению рН, и остается обнаружить в течение вакуоли люмена 20,21. Следовательно, флуоресценция GFP тега сохраняется в вакуоль долго после того, как остальная часть груза деградирует, и вся клетка на основе количественной оценки интенсивности груза может быть неточным из-за долговременной GFP флуоресценции в вакуоль.
Для того, чтобы преодолеть недостатки вакуолярная флуоресценции GFP, ранее мы использовали superecliptic рНluorin, рН-чувствительный вариант GFP , который флуоресцирует ярко при нейтральном значении рН, но теряет флуоресценцию в кислой среде , такой как просвет вакуоли / лизосомы 20,22,23. Размещение тега pHluorin на цитоплазматической хвост эндоцитических грузов позволяет визуализировать грузов на плазматической мембране и на ранних эндосом, где метка pHluorin остается открытой в цитоплазму (рис 1А). В ранние эндосомы созревают, эндосомный сортировочный комплекс необходим для транспорта (ESCRT) машины пакеты поверхностно-локализованные грузов в пузырьки , которые BUD в просвет эндосом, генерируя мультивезикулярные тел (MVBs) 24. Для грузов, которые были включены во внутренние MVB везикул, тег pHluorin обращен к везикулы просвет. Внутренние MVB везикулы подкисляют; Таким образом, pHluorin-меченый грузов теряют флуоресценцию на ранних эндосом , поскольку они созревают в MVBs 20. Последующее слияние MVB с вакуоли обеспечивает содержание MVB просветадеградации и pHluorin метки остаются гас в кислой среде вакуоли просвет.
В настоящем документе приводится подробное описание количественных анализов с использованием эндоцитических с цитоплазматическими грузов pHluorin тегов в дрожжах. Штаммы, экспрессирующие pHluorin-маркированные грузы могут быть использованы в кинетических и / или конечных точек анализов, в зависимости от свойств и торговли поведения конкретного груза. Кроме того, некоторые pHluorin-меченый грузов поддаются методам анализа с высокой пропускной способностью, в том числе проточной цитометрии. Важно отметить, что тег pHluorin является универсальным инструментом для изучения эндоцитических событий в живых клетках, что позволяет количественно оценить эндоцитоза и сравнения функции эндоцитотического в дикого типа и мутантных штаммов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Применение pHluorin количественно оценить эндоцитических событий в клетках дрожжей использует трансмембранных грузов , в котором флуоресцентная метка слита с цитоплазматическим хвостом белка (Рис . 1А) Для анализов, описанных здесь, ярко грузы флуоресцентные, когда тег p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Gero Miesenböck and Tim Ryan for sharing pHluorin cDNA used to generate reagents in this study, Nathan Wright, Joanna Poprawski and Lydia Nyasae for excellent technical assistance, members of the Wendland lab for helpful discussions, and Michael McCaffery and Erin Pryce at the Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) for advice and assistance with microscopy and flow cytometry. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (to B.W., GM60979) and the National Science Foundation (to B.W., MCB 1024818). K.W. was supported in part by a training grant from the National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. was supported by developmental funds from the Department of Biological Sciences at Duquesne University and National Science Foundation CAREER grant 553143.
Materials
| Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
| BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
| Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
| L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
| Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
| X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
Referências
- Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123 (2), 305-320 (2005).
- Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis. Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).
- Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biol. 9 (3), e1000604 (2011).
- Hansen, C. G., Nichols, B. J. Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis. J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).
- Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway. Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).
- Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase. J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).
- Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin. J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).
- Prosser, D. C., Wendland, B. Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis. Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).
- Kohno, H., et al. Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).
- Evangelista, M., et al. a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis. Science. 276 (5309), 118-122 (1997).
- Kübler, E., Riezman, H. Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast. EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).
- Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface. Cell. 135 (4), 714-725 (2008).
- Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1. EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).
- Nikko, E., Pelham, H. R. B. Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters. Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).
- O’Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. 2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3. Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).
- O’Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6. J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).
- Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O’Donnell, A. F. α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).
- Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).
- Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras. Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).
- Bokman, S. H., Ward, W. W. Renaturation of green-fluorescent protein. Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
- Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex. ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).
- Ausubel, F. M. . Curr Prot Mol Biol. , (1991).
- Urbanowski, J. L., Piper, R. C. Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole. Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).
- Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast. Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).
- Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis. Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).
- Aguilar, R. C., et al. Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).
- Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases. J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).
- Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15. J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).
- Alvaro, C. G., et al. Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2. Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).
- Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases. Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).
- Becuwe, M., Léon, S. Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5. eLife. 3, (2014).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices. Cell. 151 (2), 356-371 (2012).
- Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -. Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3. Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).
- Nickerson, D. P., Merz, A. J. LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies. Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).
- Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. Yeast endocytosis assays. Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).
- Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein. Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).
- Miliaras, N. B., Park, J. -. H., Wendland, B. The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains. Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).
- Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).
